酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)介紹

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)1. ELISA的原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化

2、效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。2. ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：2.2.1 雙抗體夾心法測抗原 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2

3、）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。 洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。 在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)

4、抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。 在一步法測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可

5、異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF

6、，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F（ab）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見6.2）。 雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。2.2.2 雙抗原夾心法測抗體 反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中

7、抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2.2.3 間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的

8、抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色 本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。 間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體

9、組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:401:200），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。2.2.4 競爭法測抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化

10、抗原時(shí)，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采

11、用此法。2.2.5 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。2.2.6 捕獲包被法測抗體 IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間

12、接測定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式見圖。 類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功

13、。2.2.7 ABS-ELISA法 ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記

14、的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。 在臨床檢驗(yàn)中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。前文（2.2）已述，ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 完整的ELISA試劑盒包含以下各組

15、分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。3.1 免疫吸附劑 已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（28）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。3.1.1 固相載體 固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，

16、抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。 ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為812的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性

17、能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時(shí)空白值較大。 良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)

18、的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。 與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪割，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項(xiàng)目的最合適的固相載體。 在ELISA中，用作固相載體的小

19、珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。 小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200

20、ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。 也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。3.1.2 包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用

21、于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表

22、面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也

23、可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。 脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。3.1.3 包被用抗原 用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成

24、份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制

25、備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)

26、往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。3.1.4 包被用抗體 包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎唬瑧?yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗(yàn)的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較

27、高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當(dāng)稀釋后直接包被，必要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì)一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。3.1.5 包被的條件 包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH78的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物

28、的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。3.1.6 封閉 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可

29、直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（見2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。3.2 結(jié)合物 結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中

30、最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 3.2.1 酶 用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,

31、HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ?.0。 HRP除符合上

32、述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗(yàn)。 國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價(jià)格昂貴

33、，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。3.2.2 抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F(ab)2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.3 結(jié)合物的制備 酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步

34、法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。 ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。 （2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。

35、辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRP最可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。 按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經(jīng)過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的

36、酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。 結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得

37、測定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測定條件和測定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽性反應(yīng)的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標(biāo)抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測定條件下進(jìn)行滴配選擇能達(dá)到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。3.2.4 結(jié)合物的保存 酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保

38、存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液?，F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長。3.2.5

39、結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測定，也可應(yīng)用這種稀釋液。3.3 酶的底物 3.3.1 HRP的底物 HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為

40、有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)。 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成

41、二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。 TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為405nm。 ABTS雖不如OPD和TM

42、B敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍。 HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（28）可穩(wěn)定1年。3.3.2 AP的底物 AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-

43、nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。3.4 洗滌液 在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。3.5 酶反應(yīng)終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。3.6 陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品 陽性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negativ

44、e control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對(duì)照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液

45、為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。3.7 參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。 優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELIS

46、A的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn)。本文將敘述板式ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細(xì)的使用說明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。4.1 標(biāo)本的采取和保存 可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而

47、血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。 血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和

48、，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑（見3.2.4）。4.2 試劑的準(zhǔn)備 按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。4.3 加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEIS

49、A板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。4.4 保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，

50、在ELISA中似不恰當(dāng)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成

51、可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4更為徹底，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長，在ELISA中一般不予采用。 保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別

52、是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。4.5 洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相

53、載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下： （1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，

54、洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間。 微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。 （2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸

55、餾水甚至可用自來水。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 4.6 顯色和比色 4.6.1 顯色 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物

56、后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。 OPD底物顯色一般在室外溫或37反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色

57、。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。4.6.2 比色 比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程

58、的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。4.6.3 酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重

59、復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.0830.01（1.0731.093），重復(fù)測定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.0830.05（1.0781.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.0002.000，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以*或over或其它符號(hào)表示。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為0.0002.900，而其線性范圍僅0.0002.0

60、00，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。 酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在1530，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動(dòng)ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)新聞?dòng)浾哒f明書。4.7 結(jié)果判斷4.7.1 定性測定 定性測