DIGE實(shí)驗(yàn)步驟

1、DIGE實(shí)驗(yàn)步驟 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16631DIGE實(shí)驗(yàn)步驟一、DIGE實(shí)驗(yàn)原理及流程二、DIGE雙向電泳樣本制備三、DIGE雙向電泳樣本標(biāo)記四、第一向電泳IEF電泳五、膠條平衡五、第二向電泳SDS電泳六、圖片掃描七、DIGE熒光圖片分析 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16632一、DIGE實(shí)驗(yàn)原理DIGE 雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)，是在傳統(tǒng)雙向電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，其分離蛋白質(zhì)混合的原理與雙向電泳是

2、一致的，主要利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的差異來分離蛋白質(zhì)混合物，同時(shí)應(yīng)用熒光染料的靈敏度及內(nèi)標(biāo)的使用等技術(shù)，使其在定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)雙向電泳。DIGE使用的熒光染料有Cy2, Cy3和Cy5，它們能與蛋白質(zhì)的賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)而使蛋白質(zhì)被標(biāo)記，被標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量幾乎不受影響，等量混合標(biāo)記好的蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳，不同凝膠之間可以通過cy2內(nèi)標(biāo)匹配，消除凝膠之間的差異，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化則通過cy3和cy5不同熒光的強(qiáng)度來體現(xiàn)。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16633一、DIGE實(shí)驗(yàn)流程圖（最小標(biāo)記法） DIGE熒光定量方法流程圖. 1、樣品準(zhǔn)備：提取

3、對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì),定量,cy3和cy5交叉標(biāo)記，同時(shí)將所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣品等量混合后cy2標(biāo)記，作為內(nèi)標(biāo)。2、蛋白質(zhì)分離：等量混合三種熒光素標(biāo)記后的蛋白質(zhì)，2D電泳分離，熒光顯色。3、蛋白質(zhì)定量分析：ImageMaster 7.0（DIGE)分析同一蛋白質(zhì)不同處理后的表達(dá)量變化。4二、DIGE雙向電泳樣本制備動(dòng)物樣本 （1）將組織切細(xì)后置于研缽中，迅速加入液氮進(jìn)行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒有明顯顆粒即可。 （2）在研缽中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （3）超聲

4、處理，破碎核酸。每個(gè)EP管超聲3次，每次58下，然后進(jìn)行離心，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （4）將上清液分裝成3管，每管約250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀過夜。沉淀完的蛋白質(zhì)于4，12000r/min，離心20min，倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊，-80保存?zhèn)溆谩?(5)在干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入200uL LB，用槍頭將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小后反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)充分分散。超聲助溶，80W，0.8秒開，0.8秒關(guān)，超聲4下后放于冰上冷卻，再重復(fù)1次，超聲后4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中

5、。純化好的蛋白質(zhì)團(tuán)塊需用LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是8.5，需調(diào)節(jié)PH值。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16635二、DIGE雙向電泳樣本制備植物樣本 （1）植物樣本置于研缽中，迅速加入液氮進(jìn)行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒有明顯顆粒即可，在研缽中加入一小勺PVPP（用于吸附植物組織破碎后釋放出的酚類物質(zhì)），用藥勺將粉末轉(zhuǎn)移至50mL離心管中。 （2）在50mL離心管中加入8mL提取液混勻，再加入8mLTris飽和酚，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min振蕩一次，總共6次，45000r/min，離30min，此時(shí)溶液會(huì)分層，下層為水相，上層為酚相，吸出上層液體，轉(zhuǎn)移

6、到15mL離心管中。 （3）加入與酚相同體積的提取液，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min振蕩一次，總共6次，4，5000r/min，離心30min，吸出上層酚相，轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中。重復(fù)一次苯酚抽提。 （4）加入最后得到的酚的5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫每隔5min振蕩一次，總共6次，于-20沉淀過夜。 （5）對(duì)沉淀過夜的蛋白質(zhì)4，5000r/min，離心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，反復(fù)吹打均勻后，4，5000r/min，離心30min。重復(fù)一次。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16636（6）加入4mL丙酮對(duì)蛋白

7、進(jìn)行洗滌，反復(fù)吹打均勻后，4，5000r/min，離心30min。重復(fù)一次操作。加入3mL丙酮，吹打均勻后將蛋白質(zhì)平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min。倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊，-80保存?zhèn)溆谩?(7)在干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入200uL LB，用槍頭將蛋白質(zhì)團(tuán)塊戳小后反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)充分分散。超聲助溶，80W，0.8秒開，0.8秒關(guān)，超聲4下后放于冰上冷卻，再重復(fù)1次，超聲后4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。純化好的蛋白質(zhì)團(tuán)塊需用LB（pH8.5）溶解，如果溶解后PH不是

8、8.5，需調(diào)節(jié)PH值。二、DIGE雙向電泳樣本制備植物樣本 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16637Alklysis buffer(LB)ReagentFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentFinal concentrationSucrose (FM 342.30）0.7MKCl（FM 74.55）0.1MEDTA（FM 292.25）50mMTris（FM 121.14）0.5MHC

9、lTo pH7.5醋酸銨甲醇溶液Ammonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸銨二、DIGE雙向電泳樣本制備8三、DIGE雙向電泳樣本標(biāo)記1: 蛋白質(zhì)定量 一般使?jié)舛刃璞ＷC在5-10ug/ul。 2：染料溶解 DIGE試劑盒放于-20保存，染料使用前需于室溫下復(fù)溫10min以上，復(fù)完溫后的染料10000r/min離心8min，加入相應(yīng)量的DMF溶解，配制染料儲(chǔ)液，使其濃度為1nmol/uL。用移液器吸取相應(yīng)量的DMF，打到裝染料的離心管管壁上，再離心將DMF甩至管底，震蕩8min后離心即可。3：標(biāo)記蛋白 染料的工作液濃度為400pmol/uL，將儲(chǔ)液和DMF按

10、照1：1.5的比例混合即可配成工作液，標(biāo)記時(shí)每50ug蛋白需要使用400 pmol染料。吸取各個(gè)樣本蛋白50ug至0.6mLEP管中，再分別吸取等量的各個(gè)樣本2混合成一管（總量以為50ug)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋白按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)的Cy3和Cy5染料，每個(gè)樣加入1uL染料，混合樣本按照蛋白總量加入相應(yīng)量的Cy2染料。 加入時(shí)先吸取所需的染料，打在各蛋白樣本EP管的管壁上，統(tǒng)一離心甩至管底，然后統(tǒng)一震蕩1min，立于冰上避光反應(yīng)30min，Cy3和Cy5可分別作為一組進(jìn)行操作，以保證各個(gè)樣本有相同的標(biāo)記時(shí)間。標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行30min后各管加入1uL 10 mM Lysine，立于冰上10min，終

11、止標(biāo)記反應(yīng)。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-16639四、第一向電泳IEF電泳1：IEF上樣蛋白質(zhì)準(zhǔn)備 每根膠條的上樣液的成分為：三管標(biāo)記的蛋白質(zhì)（cy2,cy3,cy5)、1%DTT、1%IPG Buffer、1溴酚藍(lán)、LB調(diào)制最終體積至460L。將樣品溶液混合均勻后，4 12000r/min，離心20min，吸取上清液450L進(jìn)行泡脹。2：上樣 取出水化盤，在底下鋪上白色紙巾（方便觀察膠條泡脹情況），調(diào)節(jié)水平備用。從冰箱取出干膠條復(fù)溫（如不復(fù)溫膠條會(huì)吸潮）。吸取離心后的樣品上清液加到水化盤的槽中，450L樣液可分3槍加入，第一二槍每槍吸160L，從槽頂端開始，沿左右邊緣加入，將

12、樣液加成一條細(xì)線，長約22cm，第三槍吸至管中樣液剩余20L左右即可，加至槽的頂端，將頂端部分覆蓋滿。調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度為20，讓膠條泡脹過夜（1012h），3：等點(diǎn)聚焦（IEF) 等點(diǎn)聚焦（IEF),等電聚焦程序?yàn)椋篠1 stp 300V 0:45Hr S2 stp 700V 0:45Hr S3 stp 1500V 1:30Hr S4 grd 9000V 3:00Hr S5 stp 9000V 4:00Hr 整個(gè)聚焦過程所用總電壓：52KVh4：膠條保存 跑完等電聚焦以后，取出膠條，吸干表面的覆蓋油，膠面朝上將膠條放入平衡管中，膠條應(yīng)置于-20保存。如果需要運(yùn)輸，則要用冰完全包埋平衡管保溫。10五

13、、膠條平衡1：作用 DDT與IAA聯(lián)合使用，還原蛋白質(zhì)的巰基，SDS使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷以利于第二向SDS電泳。2：實(shí)驗(yàn)步驟 （1）：取出放置有膠條的平衡管，每管加入10mL左右去離子水洗掉膠條表面的覆蓋油，去掉去離子水。 （2）：SDS平衡液加入100mM DTT混勻后，每支平衡管加入8mL平衡液進(jìn)行平衡15min，去掉平衡液。 （3）：SDS平衡液加入250mM IAA混勻后，每支平衡管加入8mL平衡液進(jìn)行平衡15min，去掉平衡液。 （4） SDS 平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)， 6M Urea (FW 60.06)，30%(v/v) Glycerol (87% v

14、/v)，2% (w/v) SDS (FW 288.38)，0.002%(w/v) Bromophenol blue。 注：在進(jìn)行IPG膠條平衡前，第二向凝膠必須準(zhǔn)備好. 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166311六、第二向電泳SDS電泳1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)分離片段大小選擇不同濃度的PAGE膠：2、配制12.5%SDS凝膠：ReagentsVolumn of reagents123456Monomer solution50.04 ml75.06 ml100.08 ml125.1 ml150.12 ml175.14 ml4 resolving gel buffer30ml45 ml60 ml7

15、5 ml90 ml105 ml10%SDS1.2ml1.8 ml2.4 ml3.0 ml3.6 ml4.2 mlDouble distilled water38.16ml57.24 ml76.32 ml95.4 ml114.48 ml133.56 ml10%ammonium persulfate600l900 l1.2 ml1500 l1800 l2.1 mlTEMED39.6l59.4 l79.2 l99 l118.8 l138.6 lTotal volumn120ml180 ml240 ml300 ml360 ml420 ml12五、第二向電泳SDS電泳30%T,2.6%C Monomer

16、 stock solution：ReagentFinal concentrationAcylamide (FW 71.08)30%N,N-methylenebisacrylamide (FW 154.17)0.8% 0.2m膜過濾，4保存4 Resolving gel buffer：ReagentFinal concentrationTris-base (FW 121.1)1.5MHCl (FW 36.46)To pH8.8 0.2m膜過濾，4保存10% SDS：ReagentFinal concentrationSDS (FW 288.38)10%0.2m膜過濾，室溫保存 輝駿生物： 免費(fèi)服

17、務(wù)熱線：400-699-166313五、第二向電泳SDS電泳 3、灌膠： 灌膠時(shí)使膠液沿著灌膠口斜面的厚塑料墊板流下，動(dòng)作均勻，灌至液面到灌膠口平為止。迅速在膠面上加入水飽和正丁醇?jí)浩揭好?，加入時(shí)使槍頭貼著玻璃長板緩慢劃動(dòng)均勻加入，當(dāng)所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌膠器的縫隙處也各加入2mL使內(nèi)外液面相平，然后再加正丁醇至沒過短板為止。蒙上保鮮膜過夜。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線：400-699-166314 4: 電泳 （1）用1x電泳緩沖液配制1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖45mL，1%的普通瓊脂糖80mL，加入溴酚藍(lán)溶液至1X后放于泡沫盒中備用，吸取低熔瓊脂糖封住SDS整個(gè)膠面。迅速從平衡管中取出

18、膠條，在裝上槽液的量筒中稍微涮洗一下，將膠條放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把膠條壓到二向膠膠面處，使膠條下端緊密接觸二向膠膠面，注意不要讓膠條下端困住氣泡。 （2）依次放好膠條后將玻璃板裝入下槽中，裝玻璃板時(shí)可傾斜放入，避免玻璃板下端產(chǎn)生氣泡。裝好玻璃板后裝上槽，然后在槽與玻璃板的縫隙處加入1%普通瓊脂糖封住縫隙防止垂直方向上漏電。在上槽中輕輕地加入上槽液（2 x 電泳緩沖液）至最大刻度處，用上槽液稀釋一倍配置成下槽液（1 x 電泳緩沖液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，蓋上蓋子，接上電極后開始電泳。電泳條件為， 2W/gel 45min后改為17W/gel繼續(xù)電泳，當(dāng)BPB跑出二向膠以后可停止電泳。 10 SDS