冰凍切片的制作方法 Microsoft Word 文檔(共6頁(yè))

1、 冰凍(bngdng)切片的制作方法一、概述(i sh) 所謂(suwi)冰凍法（Freezing method），就是先將組織塊進(jìn)行冰凍，水分成為包埋介質(zhì)，組織塊在一定溫度和時(shí)間內(nèi)變硬，然后使用切片機(jī)進(jìn)行薄片切割的一種方法。 (一) 冰凍切片法分類一般冰凍切片機(jī)：用Co2氣、液氮等，通過(guò)制冷的氣體或液體冰凍組織塊與切片刀，因受周圍環(huán)境的影響，夏季不易操作。半導(dǎo)體制冷切片機(jī)，通過(guò)半導(dǎo)體材料的制冷原理，使組織塊和刀冷凍，并需要循環(huán)水降除半導(dǎo)體材料的高熱，夏季不易操作。恒冷箱式切片機(jī)，不受外界溫度的影響，不需要循環(huán)水，四季都能切成非薄的切片，操作方便用時(shí)間短，用途廣泛是目前最為理想的切片機(jī)。（二）

2、恒冷箱式切片機(jī)及切片法 機(jī)器構(gòu)造：（1）制冷室：有輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切片機(jī)的手輪在室的右外側(cè)壁；組織托臺(tái)放組織托用；速冰冷錘，是鑄鐵圓塊，能迅速吸取組織中熱量，起速凍作用。（2）開(kāi)關(guān)：電源開(kāi)關(guān)；溫度設(shè)定調(diào)節(jié)鍵；時(shí)鐘鍵；除霜時(shí)間設(shè)定鍵；半導(dǎo)體速凍鍵；（按此健在十分鐘里提高溫度-4攝氏度）。（3）切片機(jī)調(diào)節(jié)系統(tǒng)：有快慢進(jìn)或退鍵，修整組織塊時(shí)可快或慢進(jìn)退機(jī)頭。組織接近刀刃時(shí)要慢進(jìn)鍵，并不停的旋轉(zhuǎn)手輪，組織修平后，松開(kāi)進(jìn)機(jī)頭鍵開(kāi)始切片。 恒冷箱式切片機(jī)最大的優(yōu)點(diǎn)不受外界溫度變化的影響，操作很方便，510分鐘內(nèi)可切出滿意的薄片，是外科病理快速診斷；酶化學(xué)的新鮮組織切片；組織化學(xué)脂質(zhì)染色；免疫組化，特別是免疫

3、熒光等技術(shù)開(kāi)展必備的儀器。（三）冷凍切片需要溫度及時(shí)間 在零下(ln xi)1520攝氏度之間，大部分組織(zzh)均能切出良好的切片。各器官組織切片的最適溫度及時(shí)間見(jiàn)下表： 各器官組織冷凍切片(qi pin)的最適溫度及時(shí)間表 組 織 溫 度 時(shí) 間 新鮮 固定后皮膚及脂肪 -26攝氏度 -28攝氏度 35min 58min胃腸、食管、膀胱 -18攝氏度 -20攝氏度 35min 56min子宮、卵巢 -20攝氏度 -22攝氏度 34min 45min腮腺、肌肉 -17攝氏度 -19攝氏度 34min 45min脾、淋巴結(jié)、甲狀腺 -16攝氏度 -18攝氏度 23min 45min腦組織 -

4、15攝氏度 -17攝氏度 23min 45min注：表中溫度及時(shí)間指組織厚度0.3-0.4 cm（四）冷凍溫度及時(shí)間的關(guān)系制冷溫度數(shù)越大對(duì)組織冰硬的時(shí)間越短，但往往是欲速越不達(dá)，組織凍過(guò)切片呈碎屑狀，得不到完整切片；并出現(xiàn)冰晶，改變組織應(yīng)有的形態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)脂肪樣細(xì)胞狀態(tài)，特別是腦組織腎透明細(xì)胞癌組織最明顯。如果按表中所示的制冷溫度操作時(shí)間稍長(zhǎng)一點(diǎn)也不會(huì)影響切片質(zhì)量。但冷凍時(shí)間太長(zhǎng)盡管冷度不是很高，也會(huì)使一些器官的組織堅(jiān)硬似骨，如子宮平滑肌瘤，卵巢纖維瘤韌帶纖維瘤等良性腫瘤組織的新鮮標(biāo)本難以制成切片。處理方法：掌握好制冷的溫度和時(shí)間，一但組織冰過(guò)，可用手指溫一溫組織塊，如果還不行，就拿到冷室外暖

5、后再切。（五）持刀器的傾斜度持刀器是用來(lái)夾持切刀片的夾子，并能調(diào)節(jié)刀的傾斜度，一般從4-6度最適當(dāng)。切片刀的傾斜度是指刀刃面和水平面所形成的角度，角度不足或過(guò)大時(shí)，均不能取切片。在傾斜度不足時(shí)，切片呈現(xiàn)鋸齒狀，橫行的波紋的切片，也不能成切片帶，嚴(yán)重時(shí)砍壞組織。在傾斜度過(guò)大時(shí)，切片帶發(fā)生縱走裂痕，嚴(yán)重時(shí)不能切取切片甚至砍壞組織塊。因切片機(jī)旋轉(zhuǎn)，絲杠向外推出組織塊，組織塊和清角度的刀相碰造成破壞組織塊。二冷凍(lngdng)切片將組織塊置于金屬(jnsh)組織托上面，（常規(guī)外科快速病理切片組織與托之間用化學(xué)膠水粘附即可，如免疫熒光，酶化學(xué)染色用OCT包埋劑，防止異熒光或影響(yngxing)酶染色

6、。）組織塊冰硬后，將連組織的金屬托固定于機(jī)頭上，按快進(jìn)或退鍵使組織塊接近于切片刀，按慢進(jìn)鍵，右手旋轉(zhuǎn)手輪至修平組織面，左手松開(kāi)按鍵，右手旋轉(zhuǎn)手輪即可切片。切片時(shí)可用防卷板，防卷板與刀片平行放置，應(yīng)略低于刀刃，與刀刃平行不能切片，低于刀刃太多不能防卷，通過(guò)調(diào)節(jié)防卷板螺絲使切片平展于防卷板下面為好。不用防卷板直接切削至組織上極留蒂，將切片用毛筆輕輕掃平與組織塊面上。將切削片從防卷板或組織塊上面粘附于切片上即可。切片的厚度按需而定，一般外科快速病理切片，免疫組化熒光法染色4-5um都能切破細(xì)胞膜，不會(huì)影響抗體與抗原的接觸。組織化學(xué)的脂肪染色，要求10-15 um；神經(jīng)鞘染色8-10 um。另外還有一

7、些病毒的免疫熒光或免疫組化染色2 um，在切薄片時(shí)可用OCT包埋劑將組織包埋于中心，這樣更容易切成 三、組織切片固定液為使組織細(xì)胞保持接近于它生前的正常狀態(tài)，在標(biāo)本制作的過(guò)程中，要經(jīng)過(guò)各種方法的處理，截止組織成分的融化消失，特別防止抗原彌散、丟失和終止分解酶的活性，以免抗原破壞而喪失抗原性，并轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)從而有利于保存。這些就是固定的意義。常用的固定液有三大類：丙酮醇類；醛類及碳化二亞胺，固定原理有二個(gè)方面：一類是使蛋白質(zhì)沉淀，另一類是使蛋白質(zhì)交聯(lián)而起固定作用。下面分類介紹。（一）丙酮和醇類對(duì)蛋白質(zhì)沉淀起固定作用，對(duì)抗原的抗原性影響小，對(duì)組織結(jié)構(gòu)上的抗原及微生物抗原的固定效果好，但對(duì)胞質(zhì)的

8、蛋白及低分子多肽較差。丙酮：優(yōu)點(diǎn)對(duì)抗原的抗原性影響小，對(duì)組織的通透性較好，缺點(diǎn)對(duì)組織的一般染色性較差。乙醇：優(yōu)點(diǎn)同丙酮但對(duì)組織的一般染色性較丙酮好，缺點(diǎn)(qudin)對(duì)組織的通透性較差。為了增加固定效果常配成卡若氏混合固定液，除能增加對(duì)組織穿透性，還能祛除細(xì)胞膜的脂質(zhì)成分，有利于抗體的穿透和減少非特異性染色。（二）醛類 對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而起固定作用，能很好的保持組織結(jié)構(gòu)，也能固定低分子多肽，是免疫酶電鏡觀察，對(duì)多肽免疫酶染色時(shí)首選醛類固定液。醛類最大的缺點(diǎn)也正是其交聯(lián)作用，造成細(xì)胞膜的通透性減少，并使大多數(shù)抗原尤其是大分子抗原喪失其抗原性。這也許是由于交聯(lián)作用使抗原分子形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)空

9、間障礙使抗體不能與抗原決定簇接觸，或者是抗原與其他分子發(fā)生分子間交聯(lián)，遮蓋了抗原決定簇。戊二醛弊病更加嚴(yán)重，故很少單獨(dú)使用。目前一般(ybn)用新鮮解聚的多聚甲醛，它的弊病比戊二醛小的多。如果控制濃度可以降低它對(duì)抗原的影響，但必須在四度下的冰箱內(nèi)進(jìn)行。4%多聚甲醛對(duì)HBSAg免疫球蛋白等影響不大，但對(duì)許多(xdu)組織的抗原，病毒抗原有明顯的損害，宜用11.5濃度，為了保存微細(xì)結(jié)構(gòu)，可加至0.2%苦味酸，或加至2%醋酸，或用多聚甲醛配成BOUIN氏液，都能增加固定效果。此外：過(guò)碘酸、賴氨酸和多聚甲醛（PLP法）對(duì)富于糖分子的組織有很好固定作用，對(duì)病毒的抗原性影響較小。其原理是：過(guò)碘酸氧化抗原的

10、糖分子,形成新的醛基通過(guò)賴氨酸的作用進(jìn)行分子內(nèi)及分子間交聯(lián)，蛋白分子的固定有多聚甲醛來(lái)完成。故多聚甲醛可增加至2%濃度。 （三）碳化二亞胺（carbodiimide）：又稱卡比馬鈣。是常用來(lái)將半抗原結(jié)合到載體蛋白上的一種水溶性物質(zhì)，它作用于羥基使之形成?；惸蛩?然后通過(guò)酰胺鍵與附近的氨基交聯(lián)起來(lái).如果羥基與氨基的位置接近，碳化二亞胺對(duì)蛋白質(zhì)的固定作用與醛類同樣有效，對(duì)抗原的遮蓋作用及降低細(xì)胞的通透性的作用比醛類小，是一種有前途的新的固定劑。 四、固定的方法常規(guī)HE染色，以甲醇、丙酮、乙醇或卡諾氏固定液均可，固定切片1-2min。免疫組化染色時(shí)先用上述固定劑415min，預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果所要標(biāo)記的

11、抗原不理想時(shí)，再選擇其他的固定劑。醛類的交聯(lián)作用具有高度的pH依賴性，pH高時(shí)交聯(lián)作用強(qiáng)，表面組織先被固定，就妨礙固定液的進(jìn)一步穿透，造成固定不均。造成固定不充分的抗原則可能發(fā)生彌散，特別在科研保存組織塊待冰凍切片時(shí)，最好用二級(jí)固定劑，第一級(jí)先用pH6-6.5多聚甲醛固定4-6小時(shí)，第二級(jí)用pH9-11同樣的固定液保存組織塊。組織塊保存，因長(zhǎng)期保存于多聚甲醛固定液中，對(duì)多數(shù)的抗原是不穩(wěn)定的，可考慮(kol)用以下的保存法：快速(kui s)冷凍，選放在液氮中，然后放在-0低溫冰箱保存(bocn)。固定后的切片低溫保存，如腺病毒抗原的冰凍切片或涂片在4.可保存2周，-5可保存2-3個(gè)月，-20

12、可保存一年以上。甲醛固定的冰凍切片，在5-15%蔗糖磷酸緩沖液中，在4可保存1-2周。五、染色（一）常規(guī)蘇術(shù)素伊紅染色（HE） 將固定后的切片水洗片刻浸染蘇術(shù)素1 min；水洗后鹽酸酒精分化；充分水洗（或用PH7.8-80氨水浸泡片刻水洗）至顯藍(lán)，伊紅染30秒；水洗切片；常規(guī)脫水、透明、封固切片。（二）組織化學(xué)染色 糖、蛋白質(zhì)和脂肪，按組織化學(xué)染色法要求進(jìn)行。（三）酶染色 按酶化學(xué)技術(shù)要求進(jìn)行。（四）免疫組化、含免疫熒光染色 按免疫組化技術(shù)進(jìn)行。冰凍切片的注意事項(xiàng)速凍：是冰凍切片的關(guān)鍵，因?yàn)橹挥兴賰霾拍軠p少組織內(nèi)的冰晶，最好的辦法是將速凍頭迅速壓在組織上，凍好后就可以切片特別適用于較脆的組織；

13、而含有脂肪組織較多的組織，最好放在液氮里處理，在液氮里冷凍要注意不要凍過(guò)頭，2-3秒鐘就要拿出來(lái)看一下，只要4/5的組織已經(jīng)凍住就可以了，否則會(huì)引起組織發(fā)脆或冷凍頭與組織分離。 、固定：切片后應(yīng)立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成細(xì)胞退變。固定液有很多種我們實(shí)踐認(rèn)為甲醇作用快，收縮小，染色較清晰，是冰凍切片最理想的固定液，如加5%的冰醋酸效果更好。3. 包埋劑：可用普通膠水(jioshu)代替，但要加入適量的水（膠水與水的比例約2：1左右）太稀了容易損傷切片刀，太稠了粘在切片上不容易洗掉，影響(yngxing)切片質(zhì)量。4. 冰凍用切片刀：不僅要磨的快，而且要磨的直，否則(fuz)切出的片子就不會(huì)平整，不能進(jìn)入抗卷板，最好能使用一次性刀片。5. 如果組織發(fā)脆，可等幾分鐘后再切，也可用手在組織上稍稍加溫，如果用手摸組織塊，最好戴手套，或用玻片間的紙夾在手與組織之間，以防感染。6. 冷凍室的溫度，冬天一般設(shè)在-19左右，夏天設(shè)在-22左右。不同的組織有不同的溫度要求，肝臟、甲狀腺組織溫度控制在