不同鉀鈉比的查氏培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力的影響

1、不同鉀鈉比的查氏培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力的影響不同鉀鈉比的查氏培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生物學(xué)性狀及致病力的影響棉花的黃萎病為一種土傳性病害，致病菌有大麗輪枝菌Vertiilliudahilae和黑白輪枝菌V.albatru1，早在20世紀(jì)90年代，張緒振等2研究發(fā)現(xiàn)，中國棉花黃萎病的致病菌主要為大麗輪枝菌。大麗輪枝菌的寄主范圍廣，目前已到達(dá)660多種，且該病原菌的變異程度高，產(chǎn)生的微菌核的抗逆性非常強(qiáng)，可在土壤中存活超過10年2，是棉花上的一種主要病害3，4，在中國的四大棉區(qū)都存在著較大的影響，目前尚未找到可以控制該病害發(fā)生的有效措施。筆者在進(jìn)展菌株的致病力測定時(shí)本文由論文聯(lián)盟搜集整理，

2、從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張獻(xiàn)龍實(shí)驗(yàn)室得到了一株純合的對(duì)照菌株V991，培養(yǎng)性狀為黑色菌核型，致病力強(qiáng)。經(jīng)過屢次繼代培養(yǎng)后，角變得到一株白色的菌株，為菌絲型，氣生菌絲茂盛，經(jīng)查氏培養(yǎng)基接種后致病力明顯弱于V991，但其性狀可以得到穩(wěn)定的遺傳。經(jīng)過rDNA-ITS分子鑒定發(fā)現(xiàn)弱毒株和強(qiáng)毒株的DNA序列完全一樣，但生物學(xué)特性及致病力完全不同。由于大麗輪枝菌的變異性非常強(qiáng)，在常規(guī)的PDA培養(yǎng)基上極易發(fā)生變異，經(jīng)過屢次繼代培養(yǎng)后，菌株的致病力也會(huì)發(fā)生減退。PDA培養(yǎng)基作為一種半合成培養(yǎng)基，用于產(chǎn)孢或擴(kuò)繁菌種較適宜，但不適于研究培養(yǎng)條件對(duì)菌株的影響。查氏培養(yǎng)液作為組分的一種培養(yǎng)基，常用于黃萎病菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，繼而對(duì)鑒

3、別寄主進(jìn)展根部接種。真菌的生長需要鉀，在叢生真菌中，缺鉀和鉀過量對(duì)真菌的生長都不利5。而且胞內(nèi)K+的大量積累對(duì)維持有機(jī)體的正常功能至關(guān)重要，K+的喪失會(huì)導(dǎo)致多種代謝途徑如糖酵解和呼吸作用等受阻6。查氏液體培養(yǎng)基中鉀、鈉含量和鉀鈉比K+/Na+是的，因此本試驗(yàn)通過調(diào)整其中的K+/Na+，對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)展改進(jìn)，用于培養(yǎng)菌株，觀察并記錄其生理生化特性以及菌株的致病性，說明培養(yǎng)基中K+、Na+及其比值變化對(duì)目的菌株的影響，以及它們與菌株致病性的關(guān)系，為病原菌的致病機(jī)理提供理論根據(jù)。1材料與方法1.1供試菌株大麗輪枝菌菌株V991bVb，白色突變株V991V，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；對(duì)照菌株Ay，由中

4、國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。1.2不同培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生物習(xí)性的影響1.2.1試驗(yàn)設(shè)置試驗(yàn)設(shè)置以常規(guī)的查氏液體培養(yǎng)基為根底，鈉鹽和鉀鹽的用量及鉀鈉比見表1，其中無鈉培養(yǎng)基A6以等摩爾的硝酸鉀代替硝酸鈉；無鉀培養(yǎng)基A7以等摩爾的磷酸氫二鈉代替磷酸氫二鉀，以等摩爾的氯化鈉代替氯化鉀。其余成分均不變，分別為蔗糖30.00g、硫酸鎂0.50g、硫酸亞鐵0.02g、瓊脂15.00g、去離子水1000L。常規(guī)的查氏培養(yǎng)液的成分參見文獻(xiàn)6，為減少沉淀將磷酸鹽分別滅菌，冷卻后在無菌條件下參加到培養(yǎng)基中7，其中K+/Na+為1.3121。1.2.2調(diào)查內(nèi)容及方法病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，沿菌落外緣打

5、孔，菌餅直徑5。再轉(zhuǎn)接到不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基中，分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、K，置于25+1培養(yǎng)箱中黑暗靜置培養(yǎng)，每隔1d觀察菌落生物學(xué)性狀并用十字穿插法測量菌落直徑。調(diào)查菌落質(zhì)地、菌落形成特征、菌落顏色、色素有無、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基類型、測量時(shí)間和菌株生長速率，培養(yǎng)15d后，完畢調(diào)查。1.3不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)大麗輪枝菌致病力影響的測定1.3.1接種病原菌的制備參照1.2.1中的查氏培養(yǎng)基的成分，依次稱重，將培養(yǎng)液100L裝入250L三角瓶內(nèi)，121、0.103Pa條件下滅菌30in。然后將在PDA平板中生長15d的供試菌株用0.7的打孔器打成菌碟，接入到查氏液

6、體培養(yǎng)液中，在25黑暗條件下，120r/in振蕩培養(yǎng)15d。1.3.2棉苗的致病力測定種子經(jīng)硫酸脫絨后，每個(gè)品種挑選飽滿的棉種，播種前用70%的乙醇浸泡5in，用5%的H22浸泡2h，無菌水沖洗23遍。采用無土基質(zhì)育苗技術(shù)育苗，將棉子播下8。保證苗床的濕度和溫度，培養(yǎng)棉苗25d至23片真葉時(shí)，即可接種。取每個(gè)品種60株棉苗，保持根部根本整齊一致，置于同一菌系的菌液中，使根充分接觸菌液。裸苗浸根接種30in，后移栽至營養(yǎng)缽中。在網(wǎng)室內(nèi)放置最低最高溫度表，記載每天的溫度狀況，均溫26左右。觀察和記錄病害的發(fā)生情況，分別于15、20、25d調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。1.3.3數(shù)據(jù)分析采用DPS5.0單因

7、素方差分析和Dunans新復(fù)極差測驗(yàn)的多重比較分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。2結(jié)果與分析2.1不同處理?xiàng)l件下培養(yǎng)基對(duì)不同菌株生物學(xué)性狀的影響不同處理?xiàng)l件下，對(duì)病原菌的培養(yǎng)性狀表型的影響如圖1、圖2所示。由圖1可知，Vb在低鉀至高鉀查氏固體培養(yǎng)基中均出現(xiàn)微菌核，但微菌核數(shù)量上有一定差異。從形態(tài)上看，無鉀培養(yǎng)基上的菌落中的氣生菌絲均勻分布于菌落外表，微菌核數(shù)量多，但生長受到了明顯的抑制。不同鉀鈉比的查氏固體培養(yǎng)基上的Vb菌株氣生菌絲明顯減少，且菌絲非常稀疏，零星分布于菌落外表。由圖2可知，V在低鉀至高鉀查氏固體培養(yǎng)基上均無微菌核產(chǎn)生，氣生菌絲在菌落外表均有分布，在不同鉀鈉比的查氏固體培養(yǎng)基上V菌株氣生菌絲較短，且

8、稀疏很多，僅在菌落外表產(chǎn)生很薄的一層菌絲。無鉀條件下，V菌落生長抑制明顯，幾乎無氣生菌絲，整個(gè)菌落呈膜狀。2.2不同鉀離子濃度對(duì)菌核型菌株微菌核數(shù)量的影響由表2可知，K+濃度上下對(duì)微菌核的產(chǎn)生有影響，K+/Na+為5.248的固體培養(yǎng)基條件下，Vb的微菌核產(chǎn)量最大，整個(gè)菌落都呈黑色，且對(duì)菌株的生長無顯著影響。無鉀處理中，菌落中同樣存在微菌核，但菌落直徑明顯低于其他處理，只相當(dāng)于其他處理菌株生長直徑的40%左右。說明在真菌生長過程中鉀離子對(duì)真菌生長有較大影響，對(duì)微菌核的產(chǎn)生也有影響，但非必要影響因素，在K+/Na+為5.248的固體培養(yǎng)基條件下，K+濃度對(duì)微菌核產(chǎn)量的影響最大。2.3不同K+/N

9、a+的查氏固體培養(yǎng)基對(duì)Vb顯微構(gòu)造的影響不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基對(duì)Vb和V的形態(tài)學(xué)影響如圖3所示，主要表如今氣生菌絲的濃密稀疏程度及培養(yǎng)基上菌絲的數(shù)量和微菌核的數(shù)量上。但從低鉀到高鉀培養(yǎng)基，Vb均能產(chǎn)生微菌核，對(duì)分生孢子大孝菌絲的分隔和微菌核的微觀構(gòu)造影響不大；V的微觀形態(tài)與常規(guī)PDA上無明顯差異，但無鉀培養(yǎng)基對(duì)真菌產(chǎn)孢量影響較大，產(chǎn)孢量明顯下降，菌絲體含量也明顯下降。2.4不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基對(duì)菌核型菌落產(chǎn)生微菌核時(shí)間的影響由表3可知，25條件下，Vb在不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生微菌核，A1、A2、A3、A5、A7、K的微菌核出如今接種后3d，A4與A6的

10、微菌核出如今接種后5d，培養(yǎng)皿上均有明顯的微菌核構(gòu)造。30條件下，低K+/Na+固體培養(yǎng)基上未見微菌核構(gòu)造，K+/Na+為20.992以上的固體培養(yǎng)基上有部分出現(xiàn)微菌核，但總體上微菌核較少。2.5不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基對(duì)菌落生長速率的影響在25條件下，從不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基菌落生長速率表4、圖4可以看出，菌落生長7d到達(dá)最快生長速率。平均生長速率約10/d。A7為無鉀培養(yǎng)基。從菌落直徑上看，無鉀培養(yǎng)基上菌株生長速率顯著低于其他培養(yǎng)基，說明在真菌生長過程中，無鉀條件會(huì)顯著影響菌株生長直徑。在30條件下，除無鉀培養(yǎng)基A7外，其他不同K+/Na+的查氏固體培養(yǎng)基的菌落生長速率無

11、顯著差異，可能是高溫導(dǎo)致菌落的生長速度降低，使菌株之間的生長速率差異不顯著。生長前期強(qiáng)弱毒株菌落的生長速率差異不明顯，生長后期弱毒株V菌落生長速率高于強(qiáng)毒株Vb，說明V對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)于Vb。從接種2周的菌落生長速率曲線可以看出，生長前中期，Vb生長快于V，靜置培養(yǎng)2周后，V生長速率反而高于Vb表5、圖5。2.6不同K+/Na+查氏固體培養(yǎng)基對(duì)菌落直徑的影響靜置培養(yǎng)15d，不同K+/Na+查氏固體培養(yǎng)基上的菌落直徑有一定的差異。對(duì)照K查氏固體培養(yǎng)基上的菌落直徑最大。在25條件下，高毒Vb菌株在低鉀培養(yǎng)基與高鉀培養(yǎng)基之間差異顯著，高毒Vb和低毒V菌株均與無鉀處理A7差異極顯著。高毒Vb和低毒V在

12、25、30條件下，無鉀處理A7與其他處理間均差異極顯著，說明無鉀條件下，Na+可以明顯抑制真菌的生長，而無鈉條件下，K+可以根本滿足真菌生長的需求，彌足Na+的缺失，使得真菌生長程度接近對(duì)照K表6、表7。2.7不同K+/Na+查氏液體培養(yǎng)基搖菌后對(duì)菌株致病力的調(diào)查在溫室條件下，將棉苗分成3組，進(jìn)展組間顯著性比較。3種鑒別寄主15dpi、20dpi、25dpi的病指結(jié)果見表8。由表8可知，與對(duì)照K相比，當(dāng)K+/Na+在較低程度時(shí)，隨著K+濃度的上升，菌株的致病力有所增強(qiáng)，A1處理中，強(qiáng)毒株Vb和弱毒株V的病指均高于對(duì)照K的病指。當(dāng)鑒別寄主接種25dpi時(shí)，Vb-A1的病指63.35高于Vb-K的

13、病指57.14；V-A1的病指25.51與V-K的病指26.88相當(dāng)。當(dāng)K+/Na+高于20以上時(shí)，菌株的致病力隨著K+濃度的升高而增強(qiáng)。無Na+處理中菌株的致病力有小幅度下降，Vb-A6在鑒別寄主接種15dpi、20dpi和25dpi時(shí)的病指依次為19.07、38.50、56.99，而Vb-K的病指依次為13.99、40.62、57.14；V-A6在鑒別寄主為15dpi、20dpi、25dpi時(shí)的病指依次為2.13、7.81、16.86，而V-K的病指依次為4.94、14.76、26.88。無K+處理中菌株的致病力明顯低于對(duì)照菌株，Vb-A7在鑒別寄主為15dpi、20dpi、25dpi時(shí)的

14、病指依次為15.39、32.04、44.93，而V-AT的病指依次為3.19、8.15和14.05，分別低于Vb-K、V-K。在K+濃度不變的條件下，Na+與病原菌的致病力初步呈正相關(guān)，Na+濃度升高，K+/Na+降低，病原菌的致病力表現(xiàn)為上升，Vb-A1在鑒別寄主為15dpi、20dpi、25dpi時(shí)的病指分別為20.20、47.37、63.35，均高于Vb-K；V-A1在鑒別寄主為15dpi、20dpi、25dpi時(shí)的病指分別為7.51、20.47、25.51，高于或近于V-K；而當(dāng)Na+濃度下降，K+/Na+比上升，病原菌的致病力表現(xiàn)為下降。在A3與A4處理中，Vb-A3在鑒別寄主為25

15、dpi時(shí)的病指為58.82，明顯高于Vb-A4；V-A3在鑒別寄主為25dpi時(shí)的病指為28.02，高于V-A4，但差異不顯著。3小結(jié)與討論通過對(duì)不同K+/Na+查氏固體培養(yǎng)基對(duì)菌株生物學(xué)特性的研究，結(jié)果說明，不同K+/Na+培養(yǎng)條件對(duì)同一菌株的形態(tài)學(xué)無影響，但對(duì)同一菌株氣生菌絲和微菌核的數(shù)量有影響。強(qiáng)毒株V991b的微菌核產(chǎn)量最大是在K+/Na+為5.248的查氏固體培養(yǎng)基上，并且高于對(duì)照K，但在無K+條件下同樣有微菌核的產(chǎn)生。說明K+濃度對(duì)微菌核的產(chǎn)生有一定影響，但非產(chǎn)生微菌核的必要影響因素，在K+濃度適中情況下會(huì)增加菌株微菌核的產(chǎn)量。與25相比，30條件下不同培養(yǎng)基上微菌核數(shù)量有明顯的下

16、降，說明高溫對(duì)微菌核的影響比培養(yǎng)基成分的影響更大。高溫會(huì)抑制微菌核的產(chǎn)生，這與白應(yīng)文等9對(duì)輪枝孢微菌核特性的研究一致。無K+條件下，25、30處理下強(qiáng)毒株Vb和弱毒株V的生長明顯受到抑制。培養(yǎng)皿的反面Vb中的微菌核明顯可見，氣生菌絲稀疏且均勻分布在菌落外表；V菌落外表幾乎無氣生菌絲，整個(gè)菌落呈膜狀。說明在無K+條件下，Na+可以明顯抑制真菌的生長，而無Na+條件下，K+可以根本滿足真菌生長的需求，彌足Na+的缺失，使得真菌生長程度與對(duì)照K根本相當(dāng)。與對(duì)照K相比，當(dāng)K+/Na+在較低程度時(shí)，隨著K+濃度的上升，菌株的致病力有所增強(qiáng)，在A1處理中，強(qiáng)毒株Vb和弱毒株V的病指均高于對(duì)照K的病指。當(dāng)K+/Na+高于20時(shí)，菌株的致病力仍然會(huì)隨著K+濃度的升高而增強(qiáng)。而無K+處理中菌株的致病力明顯低于對(duì)照菌株，隨著接種時(shí)間的延長，這種