肥達(dá)試驗(yàn)和沉淀反應(yīng)試驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱肥達(dá)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)日期院 系專 業(yè)班 級(jí)姓 名學(xué) 號(hào)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)肥達(dá)反應(yīng)的原理、方法以及結(jié)果分析。理解肥達(dá)反應(yīng)在傷寒和副傷寒桿菌感染檢測(cè)中的 應(yīng)用。、實(shí)驗(yàn)器材試劑：生理鹽水、患者血清、傷寒桿菌H菌液、傷寒桿菌O菌液、甲型副傷寒桿菌H液、乙型副傷寒桿菌H菌液器材：水浴鍋、冰箱、小試管32支、試管架、記號(hào)筆、移液槍三、實(shí)驗(yàn)原理.傷寒桿菌有三種抗原：分別為菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、體表抗原（Vi 抗原）。其中以O(shè)抗原及H抗原的抗原性較強(qiáng)，而Vi抗原的抗原性不強(qiáng)，且相應(yīng)抗體效價(jià) 低且為時(shí)短暫，隨細(xì)菌的消除而消失，故不列為肥達(dá)試驗(yàn)的檢測(cè)項(xiàng)目。（但其檢查有助于發(fā) 現(xiàn)傷寒帶菌者。

2、）當(dāng)抗原遇到特異性抗體（抗O及抗H）時(shí)，便會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)，通過對(duì)凝 集物量多少來(lái)推算病人體內(nèi)抗體的多少，以協(xié)助診斷、治療及判斷預(yù)后。.用已知的傷寒沙門菌菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒沙 門菌、乙型副傷寒沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清做試管或微孔板凝集實(shí)驗(yàn)，測(cè)定受 檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)的試驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)過程及步驟.取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號(hào)。.32支小試管，用移液槍各注入0.5ml生理鹽水。.第一管內(nèi)加入1： 10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對(duì)倍稀釋,依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第

3、8管為對(duì)照。第二排、第三排、第四排以相同步驟加入患者血清。.第一排各管內(nèi)注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三 排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml。.置于56水浴箱24小時(shí)。.放冰箱過夜或放37水浴箱18小時(shí)后觀察結(jié)果。.結(jié)果觀察最強(qiáng):上液澄清，細(xì)菌全部凝集沉淀于管底。強(qiáng)：上液輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集沉淀于管底。弱：上液混濁，細(xì)菌少部分凝集。不凝：液體呈乳狀與對(duì)照管相同。五、實(shí)驗(yàn)總結(jié).結(jié)果與分析：先觀察對(duì)照管，正確結(jié)果應(yīng)無(wú)凝集現(xiàn)象，再觀察各試驗(yàn)管的凝集現(xiàn)象，凝集程度以“+”多 少表示之。（+）最強(qiáng)，上液澄清，細(xì)

4、菌全部凝集沉淀于管底。（+）強(qiáng)，上液輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集沉淀于管底。（+）弱，上液混濁，細(xì)菌少部分凝集。（-）不凝，液體呈乳狀與對(duì)照管相同。效價(jià)判定：以能出現(xiàn)“+”凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價(jià)。一般認(rèn)為O抗體效價(jià)在1： 80以上，H抗體效價(jià)在1： 160以上，有輔助診斷意義。H甲或H乙達(dá)到1： 80或以上具有診斷意義。但在分析結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意以下兩點(diǎn)：（1）非腸熱癥患者，由于曾接種過傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區(qū)有過隱性感染或患過 傷寒，副傷寒，以及回憶反應(yīng)等原因，也可呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。不過，由這些原因所引起的陽(yáng)性 反應(yīng)主要是H抗體升高，O抗體效價(jià)一般不高，同時(shí)，每隔57天試血一次

5、，其抗體效價(jià) 一般不會(huì)隨病程而升高。上述這些都有別于現(xiàn)癥感染。（2）少數(shù)腸熱癥患者，由于發(fā)病初期曾使用大量抗生素，或機(jī)體有免疫缺陷病，或機(jī)體反 應(yīng)性極弱等原因，抗體效價(jià)可以很低，甚至為陰性結(jié)果。因此不能只根據(jù)肥達(dá)氏試驗(yàn)的結(jié)果去作簡(jiǎn)單肯定或否定的結(jié)論，必須結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍星闆r，既 往接觸史，以及臨床癥狀和體征，做出正確的判斷。.肥達(dá)反應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：肥達(dá)反應(yīng)是診斷傷寒副傷寒的輔助診斷，其結(jié)果的解釋必須結(jié)合臨床變現(xiàn)和病程，病史，以 及地區(qū)流行病學(xué)情況。機(jī)體患傷寒、副傷寒，一般于發(fā)病后12周內(nèi)血液中出現(xiàn)特異性抗體并且隨著病程延長(zhǎng)而效 價(jià)漸升，此時(shí)即可為陽(yáng)性，第4周可達(dá)峰值，以后又逐漸降低。一般以“O”凝集

6、效價(jià)在1/80或以上和H”在1/160或以上為陽(yáng)性。O抗體主要是IgM,出現(xiàn)較早；H抗體主要是IgG,出現(xiàn)較晚。根據(jù)此特點(diǎn)，肥達(dá)試驗(yàn)結(jié)果有 如下診斷價(jià)值：二者均超過正常值，患傷寒的可能性大；二者均在正常值內(nèi)，患傷寒的可能性?。籋抗體效價(jià)超過正常值，O抗體效價(jià)正常，可能是接種了傷寒菌苗或者是接種的回憶反應(yīng); O抗體效價(jià)超過正常值，H抗體效價(jià)正常，可能是傷寒早期或者其他沙門氏菌感染； 一般間隔12周復(fù)查，若抗體效價(jià)比前次結(jié)果增高24倍，則具有診斷價(jià)值。選擇題：請(qǐng)正確點(diǎn)選肥這反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果與相應(yīng)的臨床意義TO TH TA IB TC I臨床意義飾寒及副佛寒感染早期/交叉反應(yīng)防寒及副傷寒感染晚期/預(yù)防接

7、種/非特異性回憶反應(yīng)市寒甲型副惰賽乙型副傷寒丙型副傷寒接種傷寒及副傷寒三聯(lián)疫苗非腸熱癥/早期用抗生素/免疫功能低下六、教師評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)日期院 系專 業(yè)班 級(jí)姓 名學(xué)號(hào)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諏?duì)流免疫電泳的原理和方法，了解其用途。二、實(shí)驗(yàn)器材器材：電子天平、錐形瓶、200ml量筒、藥匙、稱量紙、水浴鍋、微波爐、洗耳球、玻片、移液管、廢液缸、打孔器、膠頭滴管、移液槍、鑷子、紗布條、電泳槽試劑：pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液、瓊脂粉三、實(shí)驗(yàn)原理1.對(duì)流免疫電泳也稱反向免疫電泳或免疫電滲電泳，其實(shí)質(zhì)是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙 擴(kuò)散技術(shù)的結(jié)合。抗原和抗體在一定的pH條件下，由于

8、帶電荷量的多少及分子量大小不同， 在電場(chǎng)中以不同的速度作定向移動(dòng)。在pH8.6的緩沖液中，多數(shù)蛋白質(zhì)抗原物質(zhì)帶負(fù)電荷， 在電場(chǎng)作用下向陽(yáng)極移動(dòng)；而其抗體大多為Y球蛋白，等電點(diǎn)較高，帶負(fù)電荷較少，且分子 量較大，電泳速度慢，受電滲作用影響向負(fù)極移動(dòng)。由于抗原抗體孔相對(duì)排列，當(dāng)兩者比例 適當(dāng)時(shí)，特異性抗原抗體互相結(jié)合形成肉眼可見的白色沉淀線。同時(shí)，由于電場(chǎng)限制了抗原 抗體分子的自由擴(kuò)散，從而提高了試驗(yàn)的敏感性，且縮短了試驗(yàn)時(shí)間。此法可用于抗原或抗 體的快速診斷。但缺點(diǎn)是分辨力低，較復(fù)雜的抗原抗體系統(tǒng)不宜用此法。2.在一定溫度和電解質(zhì)存在的條件下，可溶性抗原與相應(yīng)抗體在比例合適處形成肉眼可見的 沉淀

9、線，稱為沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)。參與反應(yīng)的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。 可溶性沉淀原分子小，單位體積內(nèi)所含的抗原量多，與抗體結(jié)合的總面積大，故試驗(yàn)時(shí)需對(duì) 抗原進(jìn)行稀釋，確保抗原與抗體以合適的比例結(jié)合，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。 目前廣泛應(yīng)用的沉淀反應(yīng)是凝膠免疫擴(kuò)散(Agar-gelimunodiffUsion)。在凝膠內(nèi)電解質(zhì)的參與 下，特異性抗原、抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散并相遇，免疫復(fù)合物在最適比例處(在平衡區(qū)帶，即抗 體決定簇的數(shù)目等于抗原決定簇?cái)?shù)目時(shí))發(fā)生沉淀。常用的12%瓊脂凝膠形成的構(gòu)架網(wǎng)孔 較大，允許分子量在20萬(wàn)以下的物質(zhì)(如絕大多數(shù)可溶性抗

10、原和抗體)通過，在凝膠中自 由擴(kuò)散。而免疫復(fù)合物因顆粒較大不擴(kuò)散，形成沉淀線。這種沉淀線是一組抗原抗體的特異 性復(fù)合物。如果凝膠中有多種不同抗原抗體存在時(shí)，便依各自擴(kuò)散速度的差異，在適當(dāng)部位 形成獨(dú)立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的 方式和特性分為單向免疫擴(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫 固定電泳等試驗(yàn)。以下為對(duì)流免疫電泳測(cè)定血清中的AFP。四、實(shí)驗(yàn)過程及步驟任務(wù)一：制備巴比妥瓊脂板.電子天平稱取0.500g瓊脂粉，加入錐形瓶，用量筒量取50ml pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩 沖液加入錐形瓶?；靹蚝笪⒉t加熱2分鐘。再

11、放入56恒溫水浴鍋中。(0.05ml/LpH8.6巴比妥緩沖液的配制方法：巴比妥-1.84g；巴比妥鈉-10.3g；加蒸餾水至 1000ml).取4.5ml已融化的1%巴比妥瓊脂溶液滴于載玻片上提示：(1)所用載玻片要潔凈、邊緣無(wú)破損，否則難以澆制瓊脂板，可用75%乙醇沖洗干凈，晾 干備用。(2)吸取瓊脂溶液的量，太少不能鋪滿整張玻片，太多將溢出玻片，都會(huì)導(dǎo)致瓊脂板制備 失敗。(3)澆制瓊脂板時(shí)動(dòng)作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。任務(wù)二：打孔L待瓊脂板凝固后在瓊脂板中間部分打四個(gè)孔，孔徑3mm,孔距 10mm。在左上角打一個(gè)孔 作為標(biāo)記。用膠頭滴管吸去空上廢液。提示：（1）打孔

12、時(shí)要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時(shí)順裂縫或底部 散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補(bǔ)或?qū)傊逶诨鹧娓咛?來(lái)回通過幾次補(bǔ)底。（2）在瓊脂板左上角打上標(biāo)記孔，有助于確定正負(fù)極方向和樣本上樣位置，通常情況下， 有標(biāo)記孔側(cè)，放置于正極端。任務(wù)三：加樣1.如下圖所示加樣，用移液槍每個(gè)孔加10微升對(duì)應(yīng)液體：以抗體Q C q抗原R抗悻O 0 D-抗原C：人待測(cè)血清；D：人陽(yáng)性血清；E：抗人血清抗體/診斷血清 提示：（1）抗原和抗體在一定的pH條件下，由于帶電荷量的多少及分子量大小不同，在電場(chǎng)中 以不同的速度作定向移動(dòng)。在pH8.6的緩沖液中，多數(shù)蛋白質(zhì)抗原物

13、質(zhì)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作 用下向陽(yáng)極移動(dòng)，而其抗體大多為Y球蛋白，等電點(diǎn)較高，帶負(fù)電荷較少，且分子量較大， 電泳速度慢，受電滲作用影響向負(fù)極移動(dòng)。（2）加樣時(shí)勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴(kuò)散結(jié)果。（3）抗原、抗體的量應(yīng)相接近時(shí)容易出現(xiàn)沉淀帶，反之不易發(fā)生，如抗原過多，可造成假 陰性結(jié)果，可通過稀釋抗原加以解決。任務(wù)四：正確放置瓊脂板至電泳槽.向電泳槽中加入約2/3體積的pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液，將加好樣的瓊脂板放入電泳槽， 有標(biāo)記孔的一側(cè)放在正極端。.用紗布條搭在瓊脂板兩側(cè)，以便電泳。提示：（1）電泳時(shí)抗原、抗體電極方向不可放反。（2）搭橋時(shí)應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會(huì)使電流不均勻，致使沉淀線