遺傳學(xué)課件第4章-原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合配色

1、 第四章 原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合名詞術(shù)語：原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞中內(nèi)含物的丟失而形成一些較小的原生質(zhì)體，稱為亞原生質(zhì)體。 它可以具有細(xì)胞核，也可以沒有細(xì)胞核，或是只有1條或少數(shù)幾條染色體，具體情況有：小原生質(zhì)體(miniprotoplast)：也稱核質(zhì)體 (nuclearplast)，具備完整細(xì)胞核，但只含有部分細(xì)胞質(zhì)。微小原生質(zhì)體(microprotoplast)：只有1條或幾條染色體的情況。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核，只有細(xì)胞質(zhì)。原生質(zhì)體融合

2、：也稱為細(xì)胞融合或體細(xì)胞雜交。是指將植物的不同種、屬甚至科間的原生質(zhì)體，通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生成為雜種植株的技術(shù)。原生質(zhì)體植物細(xì)胞小原生質(zhì)體（核質(zhì)體）胞質(zhì)體細(xì)胞膜細(xì)胞壁細(xì)胞核微小原生質(zhì)體染色體 第一節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)一、原生質(zhì)體培養(yǎng)的發(fā)展歷史要進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，首先必須分離原生質(zhì)體，即去除細(xì)胞壁，得到完整的裸露細(xì)胞。 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究中幾個(gè)重要的成就：1880年，Hanstein首次提出原生質(zhì)體(protoplast)一詞。1892年，Klercker采用機(jī)械法分離原生質(zhì)體，但效率極低，無法進(jìn)行培養(yǎng)和再生。甜菜洋蔥蘿卜黃瓜1960年，英國諾丁漢大學(xué)的Cocking教

3、授首次使用纖維素酶酶解法處理番茄的幼根，獲得了大量具有高度活性的原生質(zhì)體。1968年后，由于纖維素酶、離析酶投入了市場，使原生質(zhì)體分離技術(shù)日益發(fā)展和成熟，原生質(zhì)體培養(yǎng)也開始成為熱門研究領(lǐng)域。1971年，Takebe 等首次將煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)成完整植株。1985年，F(xiàn)ujimura 等獲得第一例禾谷類作物，即水稻原生質(zhì)體的再生植株。 1986年，Spangenberg 等由甘藍(lán)型油菜的單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植株。（白菜型、芥菜型和甘藍(lán)型 ）BACK 隨后，其它植物上也逐漸有原生質(zhì)體再生植株成功的報(bào)道，包括糧食作物、油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和一些藥用植物。 據(jù)1993統(tǒng)計(jì)，已有49個(gè)科，146個(gè)屬

4、的320多種植物，都可經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植株。雖然大體上仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主，但已從一年植物生向多年生植物、從草本植物向木本植物、從高等植物向低等植物擴(kuò)展。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義1、為細(xì)胞融合提供直接方法2、為遺傳轉(zhuǎn)化提供新的途徑 原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通過電擊穿孔法、PEG法等方法，將基因?qū)朐|(zhì)體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。3、利用原生質(zhì)體培養(yǎng)中廣泛發(fā)生的變異，選育新品種。4、用于細(xì)胞器的分離與轉(zhuǎn)移 由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的障礙，可以進(jìn)行亞細(xì)胞水平的操作研究。如葉綠體、線粒體、細(xì)胞核、染色體等的攝取。在攝取細(xì)胞器后進(jìn)行培養(yǎng)，獲得再生植株，根據(jù)再生植株的表現(xiàn)，即可進(jìn)行遺

5、傳分析，研究某種細(xì)胞器的功能或其所控制的性狀。 也可以通過細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移，使物種獲得相應(yīng)的性狀。 5、 用于理論研究 如細(xì)胞壁的生物合成、原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)與功能、激素的作用機(jī)理、病毒的侵染機(jī)理等。 原生質(zhì)體研究已在細(xì)胞生物學(xué)、生物技術(shù)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)、病毒學(xué)、育種學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。6、用于種質(zhì)資源保存 A scheme of plant protoplast PlantsSuspension cellsPre-treatmentenzymolysisPurification Vigour testCuture and regeneration三、原生質(zhì)體的分離 1、取材：材料的類別對原

6、生質(zhì)體培養(yǎng)很重要 可采用離體培養(yǎng)植株、田間或溫室植株，利用其葉片、葉柄、莖段等均可分離原生質(zhì)體，但一定要選用幼嫩部分。 近年來，為了提高原生質(zhì)體再生的頻率，最常用的是以下幾類材料：無菌試管苗的葉片上胚軸和子葉處于對數(shù)生長期的細(xì)胞懸浮系2、酶的種類和作用原生質(zhì)體分離的效果主要取決于酶的種類和濃度。目前主要使用的酶有： 果膠酶類 纖維素酶類 半纖維素酶類和崩潰酶等 有時(shí)還會(huì)使用蝸牛酶。 1）果膠酶類 從根霉或黑曲霉中提取，能降解中膠層，使細(xì)胞從組織中釋放出來。 常用的果膠酶商品制劑：Pectinase SigmaMacerozyme R-10 Japan Pectolyase Y-23 Japan

7、 (價(jià)格昂貴) 2）纖維素酶類 從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，其作用是降解細(xì)胞壁中的纖維素，使原生質(zhì)體釋放出來。常用的商品酶制劑：EA-867 中科院上海植生所Cellulase Onzuka R-10 JapanCellulase Onzuka RS Japan（價(jià)格昂貴）Meicelase P JapanCellulase USADriselase（崩潰酶，具多種活性） Japan 3）半纖維素酶用于降解細(xì)胞壁中的半纖維素，主要商品制劑有： Hemicellulase H-2125 Sigma Rhozyme HP-150 USA4）蝸牛酶：分離孢粉素、胼胝質(zhì) 各公司生產(chǎn)的酶的效果不盡

8、相同，使用時(shí)應(yīng)予以注意。必須控制好濃度、溫度和處理時(shí)間，例如： Cellulase Onzuka R-10 Japan 22h Cellulase Onzuka RS Japan 3-5h（兩種纖維素酶的活性大約差10倍） 3、酶液的滲透壓 原生質(zhì)體的一個(gè)基本屬性是滲透破損性。因此，酶液、原生質(zhì)體洗滌液及培養(yǎng)基中都要加入適量的滲透壓穩(wěn)定劑。常用的穩(wěn)定劑分為兩類： 1）糖溶液系統(tǒng) 2）鹽溶液系統(tǒng) 1）糖溶液系統(tǒng) 多用甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，目前廣泛使用的是甘露醇和山梨醇。蔗糖因?qū)υ|(zhì)體培養(yǎng)不利，很少使用。 2）鹽溶液系統(tǒng) 主要使用：KCl、MgSO47H2O 4、細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑 細(xì)胞質(zhì)

9、膜穩(wěn)定劑，能防止質(zhì)膜破壞，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，保持原生質(zhì)體的活性，促進(jìn)細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂等。 常用的質(zhì)膜穩(wěn)定劑有：葡聚糖硫酸鉀、CaCl2H2O、KH2PO4等。 MES：2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid，即2- 氮嗎啉乙烷磺酸 ，可穩(wěn)定酶液的pH值。 牛血清蛋白：可減少酶解過程中對細(xì)胞器的損傷，有利于原生質(zhì)體的存活。 5、酶（混合）液的組成: 強(qiáng)活性的酶液配方，處理時(shí)間為3-5h： Pectolyase Y-23 0.1% Cellulase Onzuka RS 2.0% 甘露醇 0.6 M CaCl2H2O 0.5% MES 5.0 mM pH

10、 5.6-5.8 弱活性的酶液配方，處理時(shí)間為20h： Macerozyme R-10 0.2% Cellulase Onzuka R-10 0.4% 甘露醇 0.6 M CaCl2H2O 0.5% MES 5.0 mM pH 5.6-5.8酶混合液的滅菌： 采用微孔過濾器除菌，其濾膜的孔徑有0.45m和0.22m兩種型號，一般采用兩級過濾法，徹底除去酶液中的微生物 6、原生質(zhì)體的游離（分離）與純化 1）原生質(zhì)體的游離 經(jīng)酶液處理后，細(xì)胞壁被降解，釋放出球狀原生質(zhì)體。為使原生質(zhì)體從組織上解離下來，酶解的最后2小時(shí)需輕度振蕩，速度為45轉(zhuǎn)/分（rpm）。酶解液酶及其它不利于原生質(zhì)體培養(yǎng)的試劑。破

11、碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞（團(tuán)）、細(xì)胞器及碎片酶解后的產(chǎn)物包括：完整原生質(zhì)體2）純化具體方法為：先用不銹鋼網(wǎng)過濾，孔徑分別為400目和200目，過濾時(shí)要加入一些培養(yǎng)基清洗，常用CPW鹽溶液。CPW鹽成分為： KH2PO4 27.2mg/L KNO3 101.0mg/L CaCl2.2H2O 1480.0mg/L MgSO4.7H2O 246.0mg/L KI 0.16mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L pH 5.8 然后，濾液中主要是原生質(zhì)體，可以采用三種方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化：A、飄浮法B、沉降法C、界面法具體介紹如下：A、漂浮法：使用的飄浮劑有蔗糖、Percoll（珀可，是由

12、聚乙烯吡咯烷酮包被的SIO2顆粒的無菌膠體懸液）、Ficoll（菲可，水溶性聚蔗糖）。原理：采用比原生質(zhì)體比重高的滲透溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面，具體方法為：1、將酶解后的原生質(zhì)體懸液混勻，通過孔徑44-169 m的篩網(wǎng)過濾（孔徑大小因植物種類而異），除去大的組織碎片和殘?jiān)?、將濾液與高滲溶液混合，在900-4500r/min下離心，小心吸取上層的原生質(zhì)體。重復(fù)洗2-3次。優(yōu)點(diǎn)：可得到較為純凈、完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：由于高滲溶液對原生質(zhì)體有傷害，因而活力高的原生質(zhì)體較少。B、離心沉淀法利用比重差別原理，在甘露醇溶液中低速離心，使原生質(zhì)體沉積在試管底部，然后再用Percoll飄浮一次。 優(yōu)

13、點(diǎn)：方法簡單。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體沉積在試管底部，造成相互間擠壓，引起原生質(zhì)體破裂。酶解產(chǎn)物+原生質(zhì)體培養(yǎng)基400g，5min0.45mol/L甘露醇碎片帶原生體C、界面法：原理：采用兩種比重不同的溶液，其中一種比原生質(zhì)體大，一種更小，使原生質(zhì)體處于兩相的界面中。界面法（甘露醇182.17，蔗糖342.3 ）優(yōu)點(diǎn)：可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，避免收集過程中原生質(zhì)體相互擠壓而破碎。酶解產(chǎn)物+原生質(zhì)體培養(yǎng)基(0.45mol/L甘露醇)0.45mol/L蔗糖400g，離心5min碎片帶（輕）原生體帶0.45mol/L蔗糖采界面法分離形成的原生質(zhì)體帶四.原生質(zhì)體活力測定目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形

14、態(tài)、胞質(zhì)環(huán)流現(xiàn)象確定原生質(zhì)體活力。FDA法：FDA（熒光素雙醋酸酯）是一種非極性物質(zhì)，本身無熒光，能夠自由穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶分解為熒光素而發(fā)出熒光，而且熒光素不能自由出入質(zhì)膜，因而可在細(xì)胞內(nèi)積累，通過熒光顯微鏡即可觀察細(xì)胞是否具有活性。伊文斯藍(lán)（Evans blue）法：伊文斯藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有當(dāng)質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞時(shí)，細(xì)胞才會(huì)被染色，故能通過細(xì)胞染色與否確定原生質(zhì)體的活力。 影響原生質(zhì)體活力的因素所用材料的基因型和生理狀態(tài)酶解條件：酶的質(zhì)量和濃度、抗氧化劑、酶解溫度、酶解時(shí)間長短、酶溶液系統(tǒng)的滲透壓分離操作條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件：操作時(shí)的溫

15、度、分離器具的影響等 以煙草為例（漂浮法）：材料1g切碎 黑暗條件下用酶液處理，震蕩，使原生質(zhì)體游離 50m過濾 在20%-30%蔗糖溶液上方輕輕加入過濾后的解離液 350g離心 收集漂浮的原生質(zhì)體 加洗滌液懸浮，150g離心洗滌2次 用液體培養(yǎng)基洗滌1次 培養(yǎng) 五、原生質(zhì)體培養(yǎng) 培養(yǎng)密度很重要（原因）：一般以104-105個(gè)/ml為宜。 一般采用的培養(yǎng)方法：液體培養(yǎng)基 固體增殖培養(yǎng)基 再分化培養(yǎng)基 器官、胚胎或植株分化。培養(yǎng)方式詳見第二節(jié)。 1）液體培養(yǎng) 分成三個(gè)階段 培養(yǎng)基：1/2無機(jī)鹽、正常有機(jī)成分、適量的水解酪蛋白、適量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露醇，pH 5.8 培養(yǎng)基

16、：1/2無機(jī)鹽、正常有機(jī)成分、適量的水解酪蛋白、適量的激素、2% 蔗糖、0.2-0.3 M甘露醇, pH 5.8 培養(yǎng)基：正常培養(yǎng)基，適量的激素、3% 蔗糖, pH 5.8 2）固體增殖培養(yǎng) 液體培養(yǎng)中，待小愈傷組織生長至1-2 mm后，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上。 固體增殖培養(yǎng)基：MS或其他基本培養(yǎng)基，添加適量的激素，使愈傷組織迅速增殖。 3）再分化培養(yǎng)基 以分裂素為主，也可不添加激素，目的是促使愈傷組織再生植株。 根據(jù)植物不同，培養(yǎng)方法及再生途徑往往也不相同。有的植物，在液體培養(yǎng)基中就可以形成胚狀體，有的植物則需要在固體培養(yǎng)基上才能形成不定芽。 原生質(zhì)體培養(yǎng)過程原生質(zhì)體固體培養(yǎng)基上小愈傷組織細(xì)胞團(tuán)

17、再生植株再分化 第二節(jié) 原生質(zhì)體融合 一、細(xì)胞融合的概念 細(xì)胞融合，也稱原生質(zhì)體融合或體細(xì)胞雜交。是指兩種異緣（種間、屬間）原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑誘發(fā)下或電沖擊下，發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株。 二、原生質(zhì)體融合的發(fā)展歷史 1909年，Kuster用低滲NaNO3溶液引起原生質(zhì)體的融合。 1972年，Carlson等用NaNO3融合方法獲得了第一株體細(xì)胞雜種，即煙草與其野生種間體細(xì)胞雜種。 但NaNO3法異核體形成率低，且對細(xì)胞有毒害。 1973年，Keller和Melchers用高pH和高鈣離子濃度（50mM CaCl22H2O，pH 10.5）溶液誘導(dǎo)煙草

18、葉肉原質(zhì)體融合，獲得種內(nèi)及種間的體細(xì)胞雜種。 但該方法異核體形成率低，而且對細(xì)胞有毒害。 1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG ）作融合劑，明顯提高了異核體的形成率，且對細(xì)胞的毒性很低。因此，該方法迅速推廣開來。 1978年，Melchers等用PEG法，成功獲得了西紅柿與馬鈴薯體細(xì)胞雜種。 1979年，Senda發(fā)明電融合方法。對原生質(zhì)體無毒害，也得到廣泛應(yīng)用。 目前，種內(nèi)、種間、屬間體細(xì)胞雜種已在許多植物上成功。 三、細(xì)胞融合的意義1、克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開辟新途徑(如利用野生種資源）2、可縮短育種年限3、利

19、用細(xì)胞融合技術(shù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞器（如葉綠體、線粒體等）及目的基因等。4、利用非對稱融合創(chuàng)造核質(zhì)雜種非對稱細(xì)胞融合技術(shù)，是利用物理因素(如X、或UV射線)輻射某一種原生質(zhì)體，使其細(xì)胞核或染色體失活；同時(shí)利用碘乙酰胺、碘乙酸或羅丹明 6-G 處理另一種原生質(zhì)體，使其細(xì)胞質(zhì)失活，然后融合這兩類原生質(zhì)體，即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的組合，或使前者中被打碎的部分染色體片段滲入到后者原生質(zhì)體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)個(gè)別基因的轉(zhuǎn)移，用以改良個(gè)別性狀。四、融合方式： 根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為：（一）、對稱融合（asymmetric fusion）即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。（二）、非對稱融合（symmetric

20、 fusion）利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合， （三）、體-配融合（gameto-somatic fusion）用親本之一的四分體小孢子原生質(zhì)體與另一親本的體細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行融合的過程。融合后的雜種細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可獲得三倍體植株。與有性雜交培育三倍體相比它省去培育四倍體的程序，提高了效率； 另一方面，親本之一為體細(xì)胞，沒有發(fā)生基因分離重組，融合產(chǎn)生的三倍體雜種有希望保持原來親本的優(yōu)良性狀(穩(wěn)定)而四分體小孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，其原生質(zhì)體之間存在差異，兩者融合后為變異雜種的選擇提供了可能（變異）。鄧秀新等已獲得柚子四分體小孢子原生質(zhì)體與伏令夏甜橙胚性愈傷組織原生質(zhì)體的三倍體

21、胚狀體。 （四）、亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合即用射線照射親本之一的原生質(zhì)體，使其細(xì)胞核失活對另一親本原生質(zhì)體用代謝抑制劑處理，抑制其細(xì)胞質(zhì)分裂雜合體具有親本之一的細(xì)胞質(zhì)與另一親本的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，但染色體的倍性不增加。 用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活羅丹明（R6G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活作用。 五、細(xì)胞融合的方法 （一）自發(fā)融合 在酶解細(xì)胞壁的過程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體

22、（可包括240個(gè)核）。這種融合稱為自發(fā)融合，或自體融合，是由于細(xì)胞間胞間連絲的收縮和粘連造成的。不是我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?（二）誘發(fā)融合 1、 鹽類誘導(dǎo)融合法 是應(yīng)用最早的融合法，但由于其異核體形成率低，而且對細(xì)胞有毒害，目前已不大采用。 如NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2、葡聚糖硫酸鈉、葡聚糖硫酸鉀等。 2、高pH高鈣誘導(dǎo)融合法 CaCl22H2O 0.05mol/L，pH9.5-10.5，可使質(zhì)膜表面特性發(fā)生改變，促進(jìn)融合發(fā)生。 但由于異核體形成率低，而且對細(xì)胞有毒害，目前也已不大采用。 3、PEG誘導(dǎo)融合法PEG （聚乙二醇）誘導(dǎo)融合的優(yōu)點(diǎn)是融合成本低（不需要特殊

23、設(shè)備）；融合子的異核率較高；融合過程不受物種限制。但缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，且PEG對細(xì)胞也有一定的毒害。PEG的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，有助于原生質(zhì)體發(fā)生相互粘連，進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG還能增加類脂膜的流動(dòng)性，也可使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器等發(fā)生融合。 ,P1P2P1 P2混合靜止1min.融 合融合液加入PEG稀 釋洗 滌加入稀釋液加入培養(yǎng)液培 養(yǎng)選 擇聚乙二醇（PEG）融合法操作程序PEG法原誘導(dǎo)生質(zhì)體融合過程融合過程：圖：A B C D E F融合原生質(zhì)體的位

24、置：BI CI DI EI FIB C D E F B C D E F 融合過程可分為三個(gè)階段： 1） 凝聚作用階段，在此期間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近。 2） 在局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連并融合，形成細(xì)胞質(zhì)橋。 3） 細(xì)胞質(zhì)橋進(jìn)一步擴(kuò)展，融合完成，形成異核體或同核體。4電融合法原理：當(dāng)原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)拿芏葢腋』旌虾?，插上電極，接通一定的交變電場，原生質(zhì)體發(fā)生極化后順著電場緊密接觸成串狀，再施以瞬間高強(qiáng)度的電脈沖，可使原生質(zhì)膜發(fā)生可逆性擊穿而實(shí)現(xiàn)融合。與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)： 不使用有毒試劑，作用條件溫和，對細(xì)胞較安全； 融合基本上是同步發(fā)生的，融合效率高； 融合技術(shù)操作

25、簡便。電融合法開發(fā)較晚，但目前的應(yīng)用比較廣泛。電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 交變電場部分 高頻直流電擊部分電融合的基本過程：質(zhì)膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于低電導(dǎo)率的溶液中，電場通電（2-4V/mm）后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，使原生質(zhì)體極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串珠狀；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖(強(qiáng)度50-200V/mm，脈沖期為20-50微秒)，即可使原生質(zhì)膜擊穿，導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。通常一次融合處理可給予幾個(gè)脈沖，脈沖間隔為1-2秒。a.未通電時(shí)，b. 通電后；c.高頻直流脈沖六、融合細(xì)胞的培養(yǎng)（4種方法）液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的

26、培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。 原生質(zhì)體懸浮液（原生質(zhì)體+培養(yǎng)基）固體平板培養(yǎng)固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在30C左右融化并與原生質(zhì)體混合而不影響其活力?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率。 缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必需合適，溫度偏高影響原生質(zhì)體的活力，偏低

27、則瓊脂糖凝固太快導(dǎo)致與原生質(zhì)體混合不均勻。液體固體雙層培養(yǎng)在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。 瓊脂糖固體培養(yǎng)基原生質(zhì)體懸浮液瓊脂糖珠培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50l一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(Thompson等,1986)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)

28、培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 瓊脂糖珠培養(yǎng)液第三節(jié) 雜種細(xì)胞的選擇及體細(xì)胞雜種植株的鑒定雜種細(xì)胞的選擇體細(xì)胞雜種植株的鑒定 一、融合體的類型 1、未融合細(xì)胞 再生植株與雙親之一相同 2、自體融合 得到“同核體”或同源多倍體 3、 異體融合 得到“異核體”，但由于融合形式不同，又可得到以下的不同結(jié)果： （1）完全和諧的細(xì)胞雜種 細(xì)胞完全融合，具有雙親各自的全套遺傳信息（包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)）。再生植株為異源雙二倍體。這是最理想的融合。 （2）部分和諧的細(xì)胞雜種 細(xì)胞完全融合，但由于染色體排斥，在細(xì)胞分裂過程中，部分染色體被排斥掉。 如甘薯+野生種的體細(xì)胞雜種 （3）核質(zhì)雜種 細(xì)胞質(zhì)來自于雙親或雙親之一，核只來自于一個(gè)親本，另一個(gè)親本的核被完全排斥。 （4）嵌合細(xì)胞雜種 細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合，但細(xì)胞核未融合，細(xì)胞核各自分裂，形成嵌合體，再生植株為嵌合體植株。 二、雜種細(xì)胞的選擇 融合處理后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的細(xì)胞。異核體的分裂和分化，往往受到抑制，因此，必要時(shí)，應(yīng)在培養(yǎng)早期對雜種細(xì)胞進(jìn)行選擇和單獨(dú)培養(yǎng)。 但并非所有的融合都需要進(jìn)行雜種細(xì)胞選擇，許多情況下也可在植株再生后再進(jìn)行