實(shí)驗(yàn)4肝糖原的提取、鑒定與定量

1、肝糖原的提取、鑒定與定量1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握組織樣品的制備方法，了解其注意事項(xiàng)。2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與蒽酮比色測(cè)定糖原含量的原理和注意事項(xiàng)，掌握其操作方法。3. 正確操作使用刻度吸管和可調(diào)微量取液器。4. 熟練運(yùn)用溶液混勻的各種方法（視具體情況，采用合適的混勻方法）。5. 正確掌握溶液轉(zhuǎn)移的操作。6. 正確操作使用分光光度計(jì)。2實(shí)驗(yàn)原理（一）肝糖原的提取、鑒定 糖原儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，采用研磨勻漿等方法可使細(xì)胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋白質(zhì)變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質(zhì)，而糖原仍穩(wěn)定地保存于上清液中，從而使用糖原與蛋白質(zhì)等其它成分分離開來。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95

2、乙醇將濾液中糖原沉淀，再溶于熱水中。3實(shí)驗(yàn)原理（二）肝糖原的鑒定 糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。這是糖原中葡萄糖長(zhǎng)鏈形成的螺旋中，依靠分子間引力吸附碘分子后呈現(xiàn)的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應(yīng)和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的存在。 CuSO4+2NaOH Na2 SO4+Cu(OH)2 2Cu(OH)2+ C6H12O6 2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH Cu2O(紅色)+H2O Cu(OH)2 CuO(黑色)+H2O4（三）肝糖原的定量 糖原在濃酸中可水解成為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進(jìn)一步脫水生成糠醛衍生物5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成

3、藍(lán)色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在(10100)mg范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。利用此反應(yīng)與同樣處理的已知葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)溶液比色，通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法（直接比較法）即可計(jì)算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織先置于濃堿中加熱，以破壞其它成分，而保留肝糖原。實(shí)驗(yàn)原理5 實(shí)驗(yàn)材料（一）儀器1. 普通離心機(jī)，室溫100恒溫水浴箱（2），722型分光光度計(jì)，精度為10mg級(jí)電子天平（1）2. 剪刀（1），鑷子（1），研缽（1）3. 試管架（1），10mL離心管（2），（10015）mm試管（6）4. 刻度吸量管（2mL1，5 mL2），100

4、0L微量可調(diào)取液器（1）5. 100mL容量瓶（1）6. 白瓷反應(yīng)板（1）6 實(shí)驗(yàn)材料（二）試劑1. 雞肝。2. 95乙醇。3. 0.31mol/L(5)三氯醋酸溶液：稱取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸餾水溶解至100 mL。4. 0.15mol/L NaCl溶液：稱取8.8g NaCl加蒸餾水溶解至1000 mL。5. 12mol/L HCl：濃HCl原液（36%38%）。6. 12.5mol/L(50)NaOH：稱取NaOH 50g，用蒸餾水溶解至100mL。7. 碘試劑：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸餾水中。7 實(shí)驗(yàn)材料8. 班氏試劑：稱取檸檬

5、酸鈉（C5H5Na3O75H2O，294.10）17.3g和無水碳酸鈉（Na2C03，105.99）100g溶于蒸餾水700mL中，加熱促溶。冷卻，慢慢傾人17.3硫酸銅（CuSO45H2O，249.68） l00mL，邊加邊搖。再加蒸餾水至1000mL，混勻，如混濁可過濾取濾液。此試劑可長(zhǎng)期保存。9. 5.35mol/L(30)KOH溶液：稱取KOH 30g，加蒸餾水溶解至100 mL。11. 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液(50mg/L)：稱取已干燥恒重的無水葡萄糖25mg，加蒸餾水溶解至500 mL。12. 17mol/L(90)H2SO4：量取蒸餾水30mL，加濃H2SO4500 mL。13. 蒽酮顯色

6、劑：稱取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此試劑不穩(wěn)定，以當(dāng)日配制為宜，冰箱保存可用45天。8操作步驟（一）肝糖原的提取 9操作步驟10注意事項(xiàng)1 肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95乙醇后，務(wù)必注意混勻。由于上清液為水溶液，比重大于95乙醇，溶液分成兩層。加之上清液已4mL多，加上等量乙醇，總量接近9mL，混勻操作比較困難，最好用傾倒混勻，或用玻璃棒攪拌混勻。2 糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產(chǎn)生的顏色與葡萄糖殘基數(shù)的多少有關(guān)。葡萄糖殘基在20個(gè)以下的會(huì)使碘呈現(xiàn)紅色，2030個(gè)之間使碘呈現(xiàn)紫色，60個(gè)以上的會(huì)使碘呈現(xiàn)藍(lán)色。淀粉中分枝鏈較長(zhǎng)，故呈藍(lán)色，而肝糖原分枝中的葡萄糖殘基在20個(gè)以下（通常812