K562細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)特異性CTL生成的研究

1、K562細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)特異性CTL天生的研究陳紹倩，杜英，王鑫，顧巧麗，黃玉敏，董子明【摘要】為了研究人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞排泄的外泌體(exses)及K562細(xì)胞總RNA刺激人樹(shù)突狀細(xì)胞D排泄的外泌體可否誘導(dǎo)出K562細(xì)胞特異性TL，接納四步離心法提取K562細(xì)胞及K562細(xì)胞總RNA刺激人樹(shù)突狀細(xì)胞的造就上清液中的外泌體，并誘導(dǎo)TL天生，以四甲基偶氮唑藍(lán)(TT)法檢測(cè)TL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表現(xiàn)：K562細(xì)胞外泌體和K562細(xì)胞RNA刺激的D和外泌體均能顯著促進(jìn)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，與未經(jīng)外泌體作用的比擬組比擬有明顯性差異P0.05。外泌體作用后對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用顯

2、著比對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)，其差異有明顯性P0.05。結(jié)論：K562細(xì)胞外泌體可以或許誘導(dǎo)出特異性抗白血病細(xì)胞的免疫反響?！娟P(guān)鍵詞】K562細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞；外泌體；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞PrdutinfSpeifiTLInduedbyExsesDerivedfrK562ellsKeyrdsK562ell；dendritiell；exse；yttxiTlyphyte外泌體exse是一種直徑在50-90n的亞細(xì)胞雙層膜顆粒,抗原呈遞細(xì)胞衍生的外泌體攜帶有富厚的抗原呈遞所必要的H-、H-、共刺激分子和熱休克卵白平分子；腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體還攜帶有腫瘤相干抗原，能誘導(dǎo)腫瘤相干抗原的特異性TL反響，是

3、一種有用的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)呈遞載體1,2。Zitvgel等3的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)行結(jié)果表現(xiàn)，用實(shí)體腫瘤抗原打擊樹(shù)突狀細(xì)胞D，其外泌體可以誘發(fā)荷瘤小鼠的腫瘤排擠效應(yīng)。rse等4的一期臨床實(shí)行用非小細(xì)胞肺癌AGE-A3或A4抗原打擊盼望期非小細(xì)胞肺癌患者(AGE抗原陽(yáng)性)自體樹(shù)突狀細(xì)胞，得到D衍生的外泌體，這種攜帶AGE腫瘤抗原的D衍生的外泌體可以誘導(dǎo)AGE特異性T細(xì)胞反響并使一部門(mén)病人的病情得到緩解和操縱，提示D衍生的外泌體可以作為無(wú)細(xì)胞治療性腫瘤疫苗用于腫瘤的免疫治療。外泌體在實(shí)體腫瘤方面的研究陳訴較多，而在白血病方面的陳訴卻甚少，因此我們提取了白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞及K562細(xì)胞總RNA刺激人樹(shù)突狀細(xì)胞的

4、外泌體，不雅察了其誘導(dǎo)的抗白血病細(xì)胞的作用，創(chuàng)造其外泌體能誘導(dǎo)K562細(xì)胞特異性TL，現(xiàn)陳訴如下。質(zhì)料和要領(lǐng)重要試劑尺度胎牛血清、淋巴細(xì)胞分散液(TBD公司產(chǎn)物);rhG-SF、rhIL-4、rhIL-2(Peprteh公司產(chǎn)物)；完全造就基RPI1640Gib公司產(chǎn)物;小鼠抗人H-I、H-II、D54IA-I、D86B7-2、D80B7-1、D40單克隆抗體Anell公司產(chǎn)物；膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟馬抗小鼠IgG(華美公司產(chǎn)物)。二甲亞砜、四甲基偶氮唑藍(lán)(Siga公司產(chǎn)物)；TRIzL試劑(Invitrgen公司產(chǎn)物)；DTAP脂質(zhì)體Rhe公司。細(xì)胞株造就K562細(xì)胞株和HL-60細(xì)胞株系鄭州大

5、學(xué)底子醫(yī)學(xué)院保存株。K562和HL-60細(xì)胞于含10%的胎牛血清(56滅活30分鐘)、1105U/L青霉素、100g/L鏈霉素、510-5l/L2-巰基乙醇和110-3l/L谷氨酰胺的RPI1640造就液，在37、5%2造就箱中造就。K562細(xì)胞總RNA制備根據(jù)TRIzL試劑說(shuō)明書(shū)抽提處于對(duì)數(shù)生恒久的K562細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完備性，紫外分光光度儀測(cè)定A260和A280數(shù)值。D的誘導(dǎo)和造就從正凡人外全面血細(xì)胞得到貼壁細(xì)胞，調(diào)解濃度至5105/l，懸浮造就于RPI1640完全造就液中，別離參加終濃度為100ng/lrhG-SF和500U/lrhIL-4,隔天半量換液，增補(bǔ)奇

6、怪造就液及細(xì)胞因子以誘導(dǎo)天生D。取上述制備的K562細(xì)胞總RNA(25l/250lpti-E)和DTAP(50l/250lpti-E)各250l，室溫下在聚苯乙烯試管中混淆20分鐘,混淆物參加造就5天的D，在37造就箱孵育4小時(shí)。4小時(shí)后吸出造就上清,參加含rhG-SF和rhIL-4的RPI1640完全造就液繼承造就。外泌體的提取取對(duì)數(shù)生恒久的K562細(xì)胞和K562細(xì)胞總RNA刺激的D的造就上清，按文獻(xiàn)外泌體4步離心法分散5,6，即：4300g離心10分鐘;1200g離心30分鐘；10000g離心30分鐘；末了，100000g超速離心60分鐘，所得到的沉淀即為外泌體。用PBS將外泌體，1000

7、00g超速離心60分鐘，洗1遍后，用PBS100l重懸,用BA法舉行定量，低溫保存?zhèn)溆谩562細(xì)胞外泌體刺激D誘導(dǎo)TL的天生外周血非貼壁細(xì)胞過(guò)尼龍毛柱得到T細(xì)胞，參加IL-2(終濃度5105U/L)造就擴(kuò)增。上述外周血D造就5天后分組，一組參加終濃度為20g/l的K562細(xì)胞外泌體與D共孵育24小時(shí)作為實(shí)行組D，另一組不加外泌體繼承造就24小時(shí)作為比擬組D。將實(shí)行組和比擬組的D和T淋巴細(xì)胞按120混淆，繼承造就3天誘導(dǎo)TL天生，然后參加靶細(xì)胞K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞，效靶比為201，TT法測(cè)2組T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的殺傷活性7。TL殺傷活性=靶細(xì)胞比擬組A值-實(shí)行組A值-

8、效應(yīng)比擬組A值/靶細(xì)胞比擬組A值100%。RNA刺激的D及外泌體誘導(dǎo)TL的天生取第7天K562細(xì)胞總RNA刺激D(實(shí)行組D)和未刺激D(比擬組D)，同上述要領(lǐng)誘導(dǎo)TL天生，并測(cè)2組T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性。取RNA刺激的D和未刺激的D排泄的外泌體各10g/l，分為2組：未刺激D排泄外泌體組(比擬組)和RNA刺激D排泄外泌體組實(shí)行組，誘導(dǎo)TL天生，用上述要領(lǐng)測(cè)各組對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)實(shí)行數(shù)據(jù)以XSD表現(xiàn)，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件舉行統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰，接納2查驗(yàn)，以a=0.05為查驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果外泌體、RNA和D的斷定如今對(duì)外泌體的斷定重要依靠形態(tài)學(xué)不雅察和卵白組身闡發(fā)。我們

9、對(duì)從造就上清液中所提取的分散樣品舉行了電子顯微鏡超微布局的不雅察、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)卵白帶型的闡發(fā)及標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟性分子的estern膠體金免疫要領(lǐng)檢測(cè)，結(jié)果表白我們的分散樣品正是外泌體。同樣也對(duì)所提取的K562細(xì)胞RNA做了瓊脂糖凝膠電泳，用紫外分光光度儀測(cè)定其A260和A280數(shù)值，檢測(cè)證實(shí)所提取的K562細(xì)胞RNA未落解。所誘導(dǎo)的D在形態(tài)和標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟性分子的表達(dá)測(cè)定也表白誘導(dǎo)出了典范的樹(shù)突狀細(xì)胞。K562細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)的TL細(xì)胞殺傷活性我們用通例四步離心法提取K562細(xì)胞造就上清液中的外泌體，后者作用于D并誘導(dǎo)TL天生，以K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，不雅察對(duì)其殺傷作用。在效靶比

10、為201和401時(shí)，外泌體作用后誘導(dǎo)的TL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率(實(shí)行組)和外泌體未作用誘導(dǎo)的TL比擬組對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率比擬力，實(shí)行組殺傷活性顯著增高(P0.05)。外泌體作用后的TL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率(實(shí)行組)與對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷率比擬力，外泌體作用后的TL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率也顯著增高(表1)，提示外泌體作用后的TL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷有特異性。這說(shuō)明K562細(xì)胞外泌體作用于D后誘導(dǎo)的TL對(duì)K562白血病細(xì)胞有特異性殺傷活性。Table1.KillingativityfTLinduedbyK562ellexsestK562ellsandHL-60ells略RNA刺激D及外泌

11、體誘導(dǎo)的TL天生用RNA提取試劑盒提取K562細(xì)胞RNA，然后用提取到的RNA刺激正凡人樹(shù)突狀細(xì)胞并提取后者造就上清液中的外泌體。分組檢測(cè)RNA刺激D刺激D為實(shí)行組，未刺激D為比擬組和RNA刺激D外泌體誘導(dǎo)的對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性RNA刺激D外泌體為實(shí)行組，RNA未刺激D為比擬組。RNA刺激D實(shí)行組誘導(dǎo)的殺傷活性和比擬組比力，殺傷活性顯著增高表2。同時(shí)用K562細(xì)胞RNA刺激正凡人樹(shù)突狀細(xì)胞造就上清液提取到的外泌體直接刺激T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)TL天生實(shí)行組，后者對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用和未刺激比擬組比力，也較顯著加強(qiáng)，提示抗原荷載后的樹(shù)突狀細(xì)胞外泌體有直接誘導(dǎo)抗原相干的TL殺傷白血病細(xì)胞的作用(

12、表3)。Table2.TLativityinduedbyDsativatedithK562ellRNA略Table3.TLativityinduedbyexsesfDsativatedithK562ellRNAGrupKillingativity略討論腫瘤的免疫治療不停都是腫瘤研究的一大熱門(mén)，從早期的IL-2、IFN、LAK細(xì)胞到比年的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，漸漸地從非特異性向特異性靠近，獲得了令人煽動(dòng)的結(jié)果8-10，但都存在如許或那樣的不敷，外泌體那么為我們展示了一片新天地。近些年對(duì)外泌體的研究創(chuàng)造，差異細(xì)胞排泄的外泌體有著差異的生理作用。造血細(xì)胞，尤其是抗原呈遞細(xì)胞衍生的外泌體攜帶有富厚的抗原呈遞

13、所必要的H-、H-、共刺激分子和熱休克卵白平分子，腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體還攜帶有腫瘤相干抗原，是一種有用的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)呈遞載體，能直接或間接作用于樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等，在體內(nèi)發(fā)揮著免疫調(diào)治作用，并且體內(nèi)作用結(jié)果更好，實(shí)體瘤方面的臨床實(shí)行結(jié)果提示，外泌體有很大潛能作為一種新型疫苗用于腫瘤的治療3,4。推測(cè)白血病細(xì)胞外泌體也有這種作用，因此我們研究了白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞外泌體是否也能誘導(dǎo)出特異性殺傷K562細(xì)胞的免疫應(yīng)答，白血病外泌體是否也有大概用于白血病的治療，實(shí)行結(jié)果驗(yàn)證了我們的推測(cè)：白血病細(xì)胞外泌體可以誘導(dǎo)出特異性TL免疫反響；同時(shí)我們的實(shí)行還證實(shí)，K562細(xì)胞RNA刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞及外泌體也可以直接誘導(dǎo)出對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，提示白血病細(xì)胞外泌體也有作為疫苗用于白