圖解RCR反應(yīng)原理類型應(yīng)用范例

1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1目 錄PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美國(guó)科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡(jiǎn)化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。3體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（I II III）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB 引物dNTP Mg2+5 34Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段5Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60

2、 70 80 90 100100 80 60 40 20耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。6PCR反應(yīng)循環(huán)729455PCR循環(huán)變性退火延伸7 PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5533變性、退火變性、退火變性、退火延伸8TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1 +P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反應(yīng)緩沖液10 xBuffer輔助因子：Mg2+91）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 DNA模板

3、一般100ng /100L。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 PCR反應(yīng)條件10（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。11（4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。12（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激

4、活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。 Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。132）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94， 30-60秒(2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。14引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源 序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間

5、避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無(wú)嚴(yán)格限制。15（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低 錯(cuò)誤摻入率增加16 PCR的應(yīng)用 1、特定DNA片段（基因、調(diào)控序列）的鑒定、分離或制備。 A、DNA B、cDNA 2、基因表達(dá)分析（原位、離體） A、基因是否表達(dá) B、基因表達(dá)水平高低 3、基因突變17基因克?。ǎ┠孓D(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜交雙鏈PCR擴(kuò)增181. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2. PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)

6、目的片段3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)原位分析基因表達(dá)的組織特異性19熒光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表達(dá)水平 通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)205353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Gree

7、n I 21反向PCR (reverse PCR) 擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列 用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 未知序列未知序列已知序列22已知序列未知序列未知序列限制酶連接酶23 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀24251、材料：含0.3Kb插入片段的克隆載體2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑261.反應(yīng)體系（50l體系）： 10 X PCR反應(yīng)

8、緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1 10mol/L引物2 模板DNA TaqE 補(bǔ)充水 三、操作步驟10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 272.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑 并混勻： 三、操作步驟10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水 12.5 L10 X P2 2.5 L283.PCR擴(kuò)增程序： 94 5-10min（預(yù)變性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸） 4 保溫30Cycles29

9、屏幕顯示方式30MainRun Enter List Edit File Lid運(yùn)行已有程序已有程序菜單刪除已有程序新建反應(yīng)程序編輯已有程序熱蓋關(guān)閉調(diào)節(jié)31EnterEnter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube輸入文件名,滿8個(gè)字符自動(dòng)生成程序名,不滿8個(gè)字符時(shí)用#終止BLOCK:屏幕顯示樣品臺(tái)溫度(樣品臺(tái)溫控方式)Sim-Tube:屏幕顯示反應(yīng)液溫度(模擬管溫控方式)Enter PCR1Segment #1 Hold Cycle END選擇

10、預(yù)變性保溫32循環(huán)內(nèi)第一步溫度和時(shí)間Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s預(yù)變性溫度和時(shí)間Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置Step #194.0C Hold 0m30s循環(huán)內(nèi)步驟數(shù)33Step #1Option？ No yes不需要拓展功能Step #255.0C Hold 0m40s循環(huán)內(nèi)第二步溫度和時(shí)間Step #2Option？ No yes不需要拓展功能Step #372.0C Hold 0m30s循環(huán)內(nèi)第三步溫度和時(shí)間34不需要拓展功能設(shè)置循環(huán)數(shù)后延伸保溫后延伸溫度和時(shí)間Step #3

11、Option？ No yesTotal Cycle= 35Segment #3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold for 10m0s35Segment #4Hold Cycle END選擇反應(yīng)完后保溫Hold at 4.0CHold for 99m0s設(shè)置反應(yīng)完后的保溫溫度和時(shí)間Segment #5Hold Cycle END終止參數(shù)設(shè)置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no預(yù)計(jì)反應(yīng)時(shí)間，程序是否保存36LidLIDTurn off heatedLid below 9C當(dāng)溫度低于9度時(shí)，熱蓋自動(dòng)關(guān)閉37RunPCR1