生物：《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段》新人教版選修

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片斷精選ppt一、基礎(chǔ)知識（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)精選ppt脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）精選ppt一個核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“OH”和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3、5、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端4、多脫氧核苷酸鏈得形成精選ppt脫

2、氧核苷酸結(jié)構(gòu)式精選pptOOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5335堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖53多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖精選ppt精選ppt5、DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu) DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為35，另一條鏈為5 3 ）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結(jié)構(gòu)脫氧核糖與磷酸交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；堿基排列在鏈的內(nèi)側(cè)兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對精選ppt精選ppt6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算規(guī)律一：DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等，任意兩個互補的堿基之和

3、相等即A=T，G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數(shù)的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈的 (A+G) /(T+C)的值互為倒數(shù)關(guān)系精選ppt規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等（二）DNA分子的特性1、穩(wěn)定性在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過氫鍵形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來精選ppt例題：甲

4、DNA分子中，A和T占25，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25， A和T 占75%，哪一個穩(wěn)定？答：甲DNA分子比乙DNA分子穩(wěn)定。因為A與T之間形成兩個氫鍵，在G和C之間形成三個氫鍵，三個氫鍵比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在DNA分子中含有較多的GC堿基對比含有較多的AT堿基穩(wěn)定精選ppt2、多樣性構(gòu)成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同，堿基對的排列順序千變?nèi)f化例題：如果有4000個堿基對，堿基對有多少種排列方式？答：堿基對排列方式有44000種3、特異性不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個DNA分子的堿基對都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生

5、物(A+T)/(G+C)的比值是特定的精選ppt（三）DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體4、模板DNA母鏈1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程精選ppt5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板7、復(fù)制過程 DNA的解旋親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈精選ppt RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物 DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。切掉引物生成岡崎片斷在核

6、酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷精選ppt DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA精選ppt邊解旋邊復(fù)制(過程）8、復(fù)制特點半保留復(fù)制（結(jié)果）9、遵循原則堿基互補配對原則精選ppt10、精確復(fù)制的原因11、復(fù)制的意義DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基互補配對能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進(jìn)行精選ppt一條雙鏈DNA分子，復(fù)制N次，形成的子代DNA分子中，含親代DNA母鏈的有兩個DNA分子，

7、占子代DNA總數(shù)的2/2N；親代DNA分子母鏈兩條，占子代DNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的2/2 N+1= 1/2N設(shè)一條DNA分子中有胸腺嘧啶為m個，則該DNA復(fù)制n次后，形成子代DNA分子需游離的胸腺嘧啶為T=(2N-1)m12、DNA復(fù)制過程中的等量關(guān)系精選ppt（四） PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1、 DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此， DNA復(fù)制需要引物2、 DNA聚合酶作用過程當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸精選ppt精選ppt3、 PCR原理在8

8、0100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈 PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器精選ppt精選ppt高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化4、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用5、 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度

9、使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行精選pptPCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出 6、 PCR技術(shù)的特點7、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液精選ppt PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為2030個脫氧核苷酸8、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點 PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的精選ppt（五） PCR的反應(yīng)

10、過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過程精選ppt靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性精選ppt復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合精選ppt靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火精選ppt延伸DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸

11、為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈精選ppt靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸精選ppt靶序列 靶序列第1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列精選ppt循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量精選ppt4、PCR 循環(huán)的結(jié)果 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行

12、DNA的延伸精選ppt二、 PCR 的實驗操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次精選pptPCR儀精選ppt微量離心管微量移液器精選ppt1、準(zhǔn)備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑精選ppt過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止

13、實驗中脫落或液體外溢精選ppt將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果精選ppt循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94C，10min30次4，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1min精選pptPCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭精選ppt（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、

14、課題成果評價1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實驗中DNA含量的測定1 、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)精選ppt2 、過程稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算精選ppt計算DNA含量（ g ）50 x (260nm的讀數(shù)） x 稀釋倍數(shù)50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02精選ppt比色杯精選ppt四、 課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點精選ppt五、實驗小結(jié)