重組子導(dǎo)入和篩選ppt課件

1、重組子導(dǎo)入、表達(dá)與挑選找找看重組DNA導(dǎo)入的目的是什么？請(qǐng)簡(jiǎn)單描畫需求被純化掉的對(duì)象轉(zhuǎn)化率是什么？該怎樣計(jì)算表達(dá)？影響轉(zhuǎn)化率的要素是什么？一、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞什么是轉(zhuǎn)化transformation？將重組DNA分子引入細(xì)菌原核細(xì)胞，使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過(guò)程。什么是轉(zhuǎn)染transfection?將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程?；蛑亟M轉(zhuǎn)染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝1原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型: 防止修飾和降解重組缺陷型： 防止重組整合轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性遺傳互補(bǔ)型： 利于挑選感染缺陷型： 防止感染宿主細(xì)胞 原核細(xì)

2、胞：大腸桿菌 真核細(xì)胞：哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞 重組體分子導(dǎo)入原核細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)菌：細(xì)菌外表正電荷添加，細(xì)胞壁和膜的通透性添加，利于DNA分子的吸附和吸收1CaCl2轉(zhuǎn)化：細(xì)菌處于0度，二價(jià)陽(yáng)離子存在的低滲溶液中，細(xì)菌膨脹成球形，處于感受態(tài)。此時(shí)加熱在42度的熱沖擊下進(jìn)入細(xì)胞，在培育基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后球形細(xì)胞恢復(fù)原狀并繁衍。轉(zhuǎn)化效率為105106/ug2電擊法electroporation： 在高壓脈沖下，細(xì)菌細(xì)胞外表構(gòu)成暫時(shí)性微孔，重組DNA進(jìn)入微孔后，脈沖終了，細(xì)胞恢復(fù)。 實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，不需求制備感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化效率高1091010/ug原理 利用高壓脈沖，在細(xì)菌細(xì)胞外表構(gòu)成暫時(shí)性的微孔，

3、重組DNA從微孔中進(jìn)入，脈沖過(guò)后，微孔復(fù)原，在豐富培育基中生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，細(xì)胞增殖，重組DNA得到大量復(fù)制。3轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子的效率什么叫轉(zhuǎn)化子？導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的宿主細(xì)胞什么叫重組子？導(dǎo)入的外源DNA為重組DNA的轉(zhuǎn)化子 表達(dá)方式：A、轉(zhuǎn)化子數(shù)/用于轉(zhuǎn)化的DNA分子總數(shù)B、轉(zhuǎn)化子數(shù)/宿主細(xì)胞總數(shù)計(jì)算例如，見書132頁(yè)影響要素：重組DNA： 分子量小，轉(zhuǎn)化率高； 親和性強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率高； ccc質(zhì)粒DNA載體轉(zhuǎn)化率高受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法： 電擊法轉(zhuǎn)化率最高；氯化鈣法次之1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、導(dǎo)入植物細(xì)胞基因槍法基因槍法gene gun是依賴高速的金屬微粒將外源基

4、因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。二基因槍介法優(yōu)點(diǎn)：1無(wú)宿主限制?？梢詫?duì)任何基因型資料進(jìn)展轉(zhuǎn)化研討；(2)靶受體幾乎包括一切具有潛在分化才干的組織或細(xì)胞。3易于操作。缺陷：如轉(zhuǎn)化頻率低、結(jié)果的反復(fù)性差，易導(dǎo)致基因沉默，實(shí)驗(yàn)本錢較高等。二基因槍法3、導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)含目的基因的表達(dá)載體動(dòng)物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動(dòng)物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯微注射分裂分化移 植發(fā)育脂質(zhì)體法重組體脂質(zhì)體受體細(xì)胞含有目的基因的重組宿主細(xì)胞如細(xì)菌可以經(jīng)過(guò) 規(guī)?；幕蚬こ滔M(fèi)目的蛋白如激素找找看基因表達(dá)系統(tǒng)有哪些？基因表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該具有什么條件？重組子挑選的意義是什么？有哪些方法可以用來(lái)挑選重組子？最正確的

5、基因表達(dá)體系：目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;生物活性高;表達(dá)產(chǎn)物容易分別純化。第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)戰(zhàn)略宿主細(xì)胞的選擇一、適宜目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求: 1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 2、能利用易得廉價(jià)原料； 3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 4、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形狀； 5、容易進(jìn)展代謝調(diào)控； 6、容易進(jìn)展DNA重組技術(shù)操作； 7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高， 8、產(chǎn)物容易提取純化。二、宿主細(xì)胞分為兩大類：1、原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等；2、真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。大腸桿菌目前仍是基因工程研討中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性

6、：對(duì)大腸桿菌的根底生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識(shí)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深化了解。有各類菌株和載體系列。目前以實(shí)現(xiàn)多種基因的高效表達(dá)。表達(dá)基因產(chǎn)物方式多樣:細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)(包含體)、細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等。易培育，本錢低。缺陷：大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。因分泌才干缺乏，真核蛋白質(zhì)常構(gòu)成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。 酵母 酵母菌是研討基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種方式，繁衍迅速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少

7、真核基因勝利表達(dá)。重組子的挑選和鑒定一根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)展挑選1 根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)志進(jìn)展挑選載體上的抗藥基因： 抗氨芐青霉素基因 抗四環(huán)素基因 抗卡那霉素基因等凡是轉(zhuǎn)入了載體的細(xì)胞都獲得了這種抗藥性，可以在平板上生長(zhǎng)菌落。 當(dāng)帶有完好抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)化無(wú)抗藥性細(xì)胞后，凡轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞都獲得了抗藥性，能在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長(zhǎng)成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能生長(zhǎng)。2 根據(jù)載體抗藥性插入失活選擇根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇 含有兩個(gè)以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個(gè)基因，并導(dǎo)致這個(gè)基因的失活，就可用兩個(gè)含不同藥物的平板，相互對(duì)照，挑選含重組DNA的菌落，這就是插入失活效

8、應(yīng)。外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重組DNA空載體不含有載體或重組DNA3 -半乳糖苷酶系統(tǒng)-半乳糖苷酶系統(tǒng) 載體：pUC、pGEM系列載體等 帶有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌DNA的短序列，其中含有編碼-半乳糖苷酶- galatosidase基因LacZ基因的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼序列，在編碼序列中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，但不破壞閱讀框架，不影響功能。 當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入的宿主細(xì)胞是含有-半乳糖苷酶C端編碼序列時(shí)，此酶的N端序列和C端序列可以互補(bǔ)成為互補(bǔ)，產(chǎn)生具有酶活性的蛋白質(zhì)-半乳糖苷酶，從而使宿主細(xì)菌在含有IPTG,X-gal的培育基上呈藍(lán)色。 當(dāng)多克隆位點(diǎn)有外源DN

9、A片段插入時(shí)，破壞此酶的N端閱讀框架，產(chǎn)生無(wú)互補(bǔ)功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細(xì)菌在含有IPTG/X-gal的培育基上呈白色。LacZ基因-半乳糖苷酶在X/gal培育基上呈現(xiàn)蘭色X-gal X(發(fā)色底物)+gal(半乳糖) -半乳糖苷酶4 根據(jù)外源性DNA片段性狀進(jìn)展挑選 根據(jù)外源基因能夠表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)缺 乏該蛋白的細(xì)菌的影響 假設(shè)外源性DNA片段可編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)為細(xì)菌生命活動(dòng)所必需，可利用該蛋白質(zhì)的性狀進(jìn)展挑選。 如亮氨酸是細(xì)菌生命活動(dòng)所必需的，當(dāng)外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因時(shí)，將該外源性DNA片段轉(zhuǎn)入亮氨酸缺陷的細(xì)菌中，放入僅含亮氨酸的培育基中，只需能利用

10、亮氨酸的細(xì)菌才干生長(zhǎng)，因此，能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為含有外源性DNA片段。二根據(jù)重組DNA的構(gòu)造特征進(jìn)展挑選 1、重組DNA的快速裂解、鑒定 初步挑選方法，根據(jù)重組DNA大小和載體DNA大小之間的差別來(lái)區(qū)分的。 瓊脂糖凝膠中進(jìn)展電泳分別，紫外燈下察看并比較與載體DNA片段遷移率，初步判別是否有外源DNA插入。2、限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)展分析 限制性內(nèi)切酶進(jìn)展酶切，凝膠電泳分析能否有外源DNA的插入。三分子程度檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上能否插入了目的基因 提取受體生物全部DNA適當(dāng)限制酶切割DNA片段用同位素標(biāo)志的目的基因片段雜交顯 出雜交帶闡明目的基因已插入分子雜交技術(shù) 核酸分子雜交是核酸分析的重要方法，是鑒定重組DNA的最通用方法， 雜交方法 適用范圍菌落印跡雜交 檢測(cè)細(xì)菌體固定在膜上后， 經(jīng)裂解釋放的DNA斑點(diǎn)雜交 檢測(cè)未經(jīng)凝膠電泳分別的， 固定在膜上的DNA或RNA原位雜交 直接檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNASouthern 印跡雜交 檢測(cè)經(jīng)酶切、凝膠電泳分別的， 已轉(zhuǎn)移到膜上的DNA Northern印跡雜交 檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分別的， 已轉(zhuǎn)移