Hsp163蛋白純化分析中文復(fù)習(xí)課程

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Hsp163蛋白純化分析中文暑期實驗生化部分一實驗?zāi)康?了解基本的分離提純蛋白質(zhì)的原理方法和技術(shù)。2提取分子和微生物實驗中自制重組細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)HSP16.3。3測定HSP16.3的分子活性，了解其分子伴侶活性及寡聚結(jié)構(gòu)。4提純和檢測Tag酶蛋白。二背景介紹1HSP16.3HSP16.3是來自結(jié)核桿菌M.tuberculosis的小分子量熱休克蛋白(430bp)。HSP16.3在正常條件下僅有少量表達(dá)，當(dāng)M.tuberculosis從對數(shù)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變中顯著表達(dá)，并成為細(xì)胞內(nèi)的主要蛋白。另外，HSP

2、16.3還是M.tuberculosis很強的抗原性蛋白，是T，B細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)的重要靶點。體外實驗表明，HSP16.3具有分子伴侶的活性，HSP16.3在39.5時可以抑制檸檬酸合成酶的熱聚集，且其活性不依賴于ATP，但不能保護(hù)檸檬酸合成酶的活性，說明HSP16.3是與部分去折疊的檸檬酸合成酶發(fā)生作用，體內(nèi)蛋白的再折疊可能還需要其它蛋白參與。通過凝膠層析還可分離出HSP16.3與檸檬酸合成酶形成的復(fù)合物，并在隨后的SDS中得到證實。HSP16.3可能是通過暴露疏水表面來行使其分子伴侶活性的。實驗表明：HSP16.3在較溫和溫度和低濃度變性劑誘導(dǎo)下，如極低濃度的鹽酸胍（0.05M），尿素（0

3、.3M）或30的溫度處理時，會暴露疏水表面使得其分子伴侶活力迅速上升。HSP16.3是144個氨基酸組成的，分子量為16277Da，其序列分析結(jié)果表明它屬于-crystalline相關(guān)的小分子量熱休克蛋白（sHSP）家族的一員，具有-crystalline蛋白家族典型的C末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。小分子量熱休克蛋白（smallheatshockprotein,sHSP）家族的蛋白具有多種不同的生物學(xué)功能，但都具有分子伴侶的活性，能與變性的蛋白質(zhì)底物作用并不依賴于ATP參與。這一類蛋白的結(jié)構(gòu)研究表明它們往往通過形成特定的寡聚結(jié)構(gòu)來發(fā)揮功能，如M.Janneschi

4、iHSP16.5形成二十四聚體，小麥HSP16.9形成十二聚體。HSP16.3是迄今為止發(fā)現(xiàn)的幾種原核生物的sHSP之一，目前，對sHSP功能，作用機制了解還很少。2Tag酶三實驗原理1、超聲波處理法破碎細(xì)菌借助超聲波的震動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時時間要稍長，使用時應(yīng)注意降溫防止過熱。Ni-NTA親和層析（Ni-NTAAffinityChromatography）（1）金屬螯合親和層析金屬螯合親和層析介質(zhì)上偶聯(lián)的配基亞氨基二乙酸鈉（IDA），在偏堿的環(huán)境中容易于二價金屬離子如Zn2，Cu2，Ni2發(fā)生可逆螯合吸附，二價金屬離子又與流動相

5、中的半胱氨酸、組氨酸、咪唑等物質(zhì)發(fā)生可逆性的螯合吸附。金屬離子在螯合介質(zhì)與分離分子間起著橋梁的作用，金屬離子一端與螯合介質(zhì)連接，另一端與被分離組分結(jié)合。這兩種結(jié)合方式都是可逆的，可以根據(jù)需要從不同結(jié)合部分解析下來。例如，以EDTA為洗脫劑可以從金屬離子與螯合介質(zhì)的結(jié)合部位洗脫下來，以咪唑為洗脫劑可以從金屬離子與被分離分子的結(jié)合部位洗脫下來，利用這一特性可以分離不同用途的蛋白質(zhì)。（2）NiIDA和NiNTAIDA只有三個金屬螯合位點，與金屬離子結(jié)合并不緊密，由此導(dǎo)致最后純化產(chǎn)物不純等問題。而NiNTA中，NTA是一個四配位基的螯合劑，可以與鎳離子六個配位基中的四個螯合，鎳離子剩下的兩個配位基則與

6、目標(biāo)蛋白六個組氨酸殘基（6xHistag）結(jié)合，在較高強度的洗脫條件下，仍保持良好的結(jié)合力。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子產(chǎn)生結(jié)合作用，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。圖1不同的配基與鎳離子的螯合（左）Ni氨三乙酸配合物，NTA與鎳離子中四個配位基結(jié)合，結(jié)合更緊密；（右）Ni亞氨二乙酸配合物，IDA與鎳離子的三個配位基結(jié)合。3、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長

7、下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。4.透析（Dialysis）經(jīng)由半透膜的兩端及透析液中的分子，經(jīng)濃度的差異而互柤產(chǎn)生自由擴散(Diffusion)的現(xiàn)象叫作透析作用。通常將半透膜制成袋狀，將生物大分子溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。透析技術(shù)可用于除鹽、除生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品。透析的動力是擴散壓，擴散壓由跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度正比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，

8、通常是4透析，升高溫度可加快透析速度。5、SDSpageSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑b-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮35min，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷，平均每兩個氨基

9、酸殘基結(jié)合一個SDS分子，這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測定，在同一凝膠上對一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白及未知蛋白進(jìn)行電泳，測定各個的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳距離（或遷移率），并對各自分子量的對數(shù)（logMr）作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知蛋白質(zhì)的電泳距離（或遷移率），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以求出未知蛋白的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的

10、檢測，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時得到關(guān)于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設(shè)計提純過程都是非常重要的。6天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（NativeGel）天然聚丙烯酰胺電泳，是指未加SDS，也未經(jīng)強還原劑如DDT和巰基乙醇處理的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳。目的是為了使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷。利用蛋白質(zhì)分子中帶有凈電荷的數(shù)目差異，以及分子質(zhì)量、形狀不同，在電場中泳動的速度和方向有區(qū)別，

11、從而達(dá)到分離的目的。在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性。與其他方法相比，NativeGel電泳分辨率較低，使用合適濃度和孔徑的凝膠、有足夠長度的凝膠、小體積加樣等方法，可提高分辨率。四、材料、儀器與步驟細(xì)胞收集和破碎材料：經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白（HSP16.3）的大腸桿菌設(shè)備：大型低溫離心機，高速低溫離心機，細(xì)胞超聲破碎儀，4/-20冰箱試劑：BufferA（25mmol/LTrisHCl,，0.15mol/LNaCl，pH8.0）實驗步驟：（1）將150ml菌液(經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌)轉(zhuǎn)入大離心瓶中（2tubes/組），離心收菌，5000rpm，10min,4oC（留沉

12、淀）；（2）配制BufferA緩沖液：配制時先分別加入4.31gTris.HCl和1.51gNaCl，用去離子水定容至500ml，HCl調(diào)pH值至8.0，配制成終濃度為25mmol/LTrisHCl,，0.15mol/LNaCl，pH8.0的溶液。（3）倒掉上清，將離心管中的菌體沉淀懸于40mlBufferA緩沖液（pET系統(tǒng)用BufferA，25mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaCl，pH8.0），再移至小燒杯中；（4）超聲破碎細(xì)菌(冰浴)：工作功率400KW,工作5秒,停止5秒,每次50個循環(huán),共3次，每次間歇12min；超聲注意事項：*盛裝菌液的小燒杯要放在冰盒底部，防止

13、超聲過程中冰融后燒杯移位；*探頭要距離燒杯底部有一定距離，大約5mm，但又不能離底部過遠(yuǎn)；*探頭一定要插入液體內(nèi)方能開機，嚴(yán)緊空載開機；工作時鉆頭要在液面中間，保證超聲效果；*超聲過程中冰會融化，應(yīng)及時添加冰。*所用超聲機適合破碎30ml以上的溶液；*基本參數(shù)都已設(shè)定，不要隨便修改已設(shè)定好的參數(shù)，開機后只需調(diào)整功率輸出旋鈕，把輸出功率調(diào)整到200W左右；一般情況下工作功率設(shè)定在200W左右即可，但由于本作超聲機鉆頭較細(xì)，加大功率至300W；*在使用中出現(xiàn)的問題應(yīng)及時通知老師；*超聲破碎后，要用去離子水再超聲五次，擦干探頭，防止殘留菌液結(jié)垢。（4）將破菌產(chǎn)物離心，12000rpm，30min,4

14、oC；（5）留上清，沉淀溶于30ul的bufferA中，4冰箱保存，分別對上清和沉淀留樣，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,鑒定表達(dá)情況和蛋白可溶情況。2.NiNTA親和層析蛋白材料：高速離心得到的蛋白上清，Ni-NTA介質(zhì)設(shè)備：制冰機，4/-20冰箱，親和層析柱，電磁攪拌器，紫外分光光度計試劑：BufferA(25mmol/LTrisHCl,，0.15mol/LNaCl，pH8.0)1mol/L咪唑溶液50mmol/LNiSO4洗脫液1（20mM咪唑）：在20ml的bufferA中加入400l1mol/L咪唑，配成終濃度為25mmol/LTris.HCl，150mmol/LNaCl，20mmol

15、/L咪唑，pH8.0的溶液；洗脫液2（200mM咪唑）：在16ml的bufferA中加入4ml1mol/L咪唑，配成終濃度為25mmol/LTris.HCl，150mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0的溶液。實驗步驟：處理介質(zhì)：向柱中加入1mlNTA介質(zhì)后，按下列順序清洗和處理層析柱：去離子水（3柱體積，約20ml）BufferA（10ml）平衡介質(zhì)。加入蛋白樣品：加入40ml超聲破菌后的蛋白上清樣品（保留穿過液），手動加液，最后保留30l穿過液樣品用作SDSPAGE檢測。洗脫雜蛋白：用10mlbufferA洗脫介質(zhì)。將柱用bufferA裝滿后放入4冰箱過夜。洗脫目標(biāo)蛋白：用

16、20ml洗脫液1（20mM咪唑）洗脫介質(zhì)，保留30l穿過液樣品用作SDSPAGE檢測；用20ml洗脫液4（200mM咪唑）洗脫介質(zhì)，手動收集，每管1ml。以bufferA為參比，測量上述三次洗脫收集的洗脫液的OD280。NTANi2瓊脂糖再生：10ml1M咪唑20ml去離子水10ml50mMNiSO410ml20乙醇加入20乙醇，封口，4保存。3.透析材料：固體NaH2PO4，透析袋，OD280峰值處的洗脫液樣品（本組由于沒有得到目標(biāo)蛋白，用的是9-2組的。）實驗步驟：配制透析緩沖液：用NaH2PO4和Na2HPO4配置1L，pH7.0的透析液（兩組共用透析液）。準(zhǔn)備透析袋：將透析袋剪切成適當(dāng)

17、長度（1020厘米），在蒸餾水中煮10分鐘，冷卻后儲放在水中。（老師準(zhǔn)備好）透析：透析袋涼至室溫，中間打結(jié)或系皮筋，用滴管向透析袋中加入OD280值最高一管樣品約1ml，兩端封口，放入透析液中過夜。注意事項：透析袋中加入蛋白樣品的量最好為一半體積，因為透析時袋外液體受滲透壓進(jìn)入袋內(nèi)，使透析袋膨脹；為避免透析袋漲破，不宜加入過多樣品，實際上加了約0.5ml。4.CrossLinking材料：經(jīng)透析的樣品設(shè)備：微量恒溫器試劑：Specialsamplebuffer（含4戊二醛，終濃度1），0.1MTrisHCl，pH7.0實驗步驟：取30l透析樣品，加入15lspecialsamplebuffer

18、,在室溫放置20min，再加5l0.1MTrisHCl停止交聯(lián)(stop)，pH7。5.SDSPAGE材料：前面實驗所留的樣，包括破菌上清樣品，破菌沉淀樣品，掛柱穿過樣品，透析交聯(lián)樣品，不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白回收樣品。蛋白電泳marker設(shè)備：蛋白電泳儀等電泳設(shè)備，Pipette，微量恒溫器（用于樣品處理），電磁攪拌器試劑：A液（Lowerbuffer）：18.17gTris0.4gSDS,pH8.8(HCl)加H2O到100ml(1.5MTris-HClbuffer)B液（Upperbuffer）：6.06gTris0.4gSDS,pH6.8(HCl)加H2O到100ml(0.5MTri

19、s-HClbuffer)C液（30%丙稀酰胺）：30g丙稀酰胺（acrylamide）0.8gN,N-亞甲雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)加水到100mlD液（10%過硫酸銨）(fresh)：0.1gammoniumpersulfate，加H2O到1ml。樣品處理液1samplebuffer：50mMTris-HCl(pH6.8)100mMDTT(or5%Mercaptoethanol)2%SDS0.1%溴酚藍(lán)(Bromophenolblue)10%甘油(Glycerol)Tris-甘氨酸電泳緩沖液：0.025mol/LTris0.25mol/L甘氨酸（pH為8.3）0.1%SDS染色

20、液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于50ml甲醇中,加入8ml乙酸和42mlH2O定容至100ml。脫色液：30%乙醇，10%乙酸,加H2O定容至1000ml。實驗步驟：SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制：根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板，在高玻璃上做好刻度線，玻璃板矮面朝外。確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制定體積的分離膠溶液。依次混合各成分。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。配制分離膠（15%runninggel）：A4.5mlC9mlH2O7.4mlTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18mlTEMED

21、orDwasaddedlast.迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，至刻度線高度，留出灌注積層膠所需空間(梳子的齒長，再加1cm)。用注射器小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水（水封）。將凝膠垂直放置于室溫下。分離膠聚合完全后(1520min)，傾出覆蓋層液體，用紙巾的邊線吸凈殘留液。按下法制備積層膠：按下表給出的數(shù)據(jù)在另一個小燒杯里制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下一步操作。在已聚合的分離膠上直接灌注積層膠，立即在積層膠溶液中插入干凈的Teflon梳子。小心避免混入氣泡，再加入積層膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將

22、凝膠垂直放置于室溫下。配制積層膠（3%runninggel）：B2.0mlC0.8mlH2O5.2mlTEMED0.01mlD(fresh)0.04mlTotal8.05mlTEMEDorDwasaddedlast.蛋白電泳樣品處理：將10l1samplebuffer加入10l洗脫蛋白樣品中，在100加熱5分鐘，以使蛋白變性。標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker也在100中加熱5min。電泳：積層膠聚合完全后，小心移出梳子，將玻璃板間的膠帶去掉，玻璃板高面朝外，固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。按預(yù)定順序加樣，每樣品加20l，使用專用的上樣槍頭，

23、每加完一個樣品在下槽緩沖液中洗滌加樣注射器。將電泳裝置與電源相接(正極應(yīng)接下槽)，調(diào)節(jié)電壓為200V。至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，然后關(guān)閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，用小鋼尺把膠刮下來。用考馬斯亮藍(lán)對SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色：考馬斯亮藍(lán)R250是一種三苯甲烷紡織染料。可將凝膠放在這一染料的甲醇乙酸濃溶液中浸泡數(shù)小時，然后經(jīng)過長時間的脫色而使過量染料從凝膠上擴散出去。用至少5倍體積的染液浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上于室溫染色2小時。脫色，觀察結(jié)果：倒出染色液，將凝膠浸泡于不加染料的甲醇乙酸溶液中，平緩搖動48小時，其間應(yīng)更換脫色液三四次。6.NativeGel材料：不同濃度咪唑洗

24、脫液洗脫蛋白回收樣品，透析樣品，標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，BSA設(shè)備：蛋白電泳儀等電泳設(shè)備，Pipette，冰盒試劑：A液（Lowerbuffer）：18.17gTris，pH8.8(HCl)加H2O到100ml(1.5MTris-HClbuffer)B液（Upperbuffer）：6.06gTris，pH6.8(HCl)加H2O到100ml(0.5MTris-HClbuffer)C液（30%丙稀酰胺）：30g丙稀酰胺（acrylamide）0.8gN,N-亞甲雙丙烯酰胺(Bisacrylamide)加水到100mlD液（10%過硫酸銨）(fresh)：0.1gammoniumpersulfate

25、，加H2O到1ml。樣品處理液samplebuffer：0.1MTris-HCl(pH6.8)0.2%溴酚藍(lán)(Bromophenolblue)，2mg20%甘油(Glycerol)Tris-甘氨酸電泳緩沖液：0.025mol/LTris0.25mol/L甘氨酸（pH為8.3）BSA牛血清白蛋白：1mgBSA溶于1ml去離子水中。*注：nativegel的試劑里不含任何的SDS或者DDT等還原性強的試劑。實驗步驟：基本和SDSPAGE操作一樣，但是有下列幾點不同：分離膠配制濃度為7.5，而不是15，濃縮膠配方一樣。配制分離膠（7.5%runninggel）：A4.5mlC4.5mlH2O8.9m

26、lTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18mlTEMEDorDwasaddedlast.蛋白樣品處理：取15l蛋白樣品加入5l的3samplebuffer，混勻，不用加熱，直接上樣。7.測活材料：目標(biāo)蛋白濃度最高的一管樣品設(shè)備：紫外分光光度計，pipette，微量恒溫器試劑：緩沖液（0.05MNa2HPO4，0.1MNaCl，pH7.0），1MDTT，2.5mg/ml胰島素（insulin）實驗步驟：按照下表設(shè)計，依次加入各種試劑（最后加insulin），每一個體系終體積為1ml。測活參比液：0.05MNa2HPO4760ul0.1MNaCl(pH7.0)1MDTT80

27、ulInsulin(2.5mg/ml)200ul2.以緩沖液（0.05mol/LNa2HPO4，0.1MNaCl，pH7.0）為空白,測反應(yīng)物在360nm處的濁度，以檢測胰島素的聚集。每組測14min，每10s記一個數(shù)據(jù)。3.按照下表加入試劑進(jìn)行測活。測活樣品液：0.05MNa2HPO4740ul0.1MNaCl(pH7.0)Proteinsample20ul1MDTT80ulInsulin(2.5mg/ml)200ul4.以緩沖液（0.05mol/LNa2HPO4，0.1MNaCl，pH7.0）為空白,測反應(yīng)物在360nm處的濁度，以檢測胰島素的聚集。每組測14min，每10s記一個數(shù)據(jù)。五

28、結(jié)果與討論1目的蛋白的洗脫曲線用BufferA+200mM咪唑(25mmol/LTrisHCl,0.15mol/LNaCl，200mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫目標(biāo)蛋白收集組分，測OD280數(shù)據(jù)，見表1。由此數(shù)據(jù)作圖，見圖2。表一、200mM咪唑洗脫的各管的OD280值管數(shù)OD28010.36520.66930.64340.53350.47360.38670.37680.326圖2、200mM咪唑洗脫的各管的OD280用緩沖液B(25mmol/LTrisHCl,0.15mol/LNaCl，200mmol/L咪唑，pH8.0)為空白對照，各管收集組分在紫外分光光度計上測定吸光度OD280，以

29、OD280為縱座標(biāo)，收集組分按順序為橫座標(biāo)作圖，可以從圖中直接得出第2管蛋白洗脫量最多即蛋白濃度最高。從OD280的數(shù)據(jù)可以看出，各管的OD280都在0.7以內(nèi)，并不太高。鑒于我們是直接取用的發(fā)酵罐的菌液，而且之前的實驗結(jié)果顯示我們的細(xì)菌濃度較高，所以我們測OD280前共對樣品稀釋了16倍。綜合考慮稀釋倍數(shù)，我們的數(shù)據(jù)結(jié)果就和別組同學(xué)的數(shù)據(jù)結(jié)果差不多了。在洗脫的過程中我們遇到最大的問題就是洗脫的速度特別的慢，從一開始用水洗柱子的時候速度就比別組慢，后來助教說是因為我們的柱子裝的太緊。有時候慢到20多秒一滴，我們就不得不在助教的幫助下把柱子弄松。我們猜測柱子的問題不僅僅是影響了實驗進(jìn)度，對洗脫效果也會有一定影響，比如洗脫的各管的OD280峰就不突出，不過對后面的實驗還不至于產(chǎn)生大的影響。2SDSPAGE凝膠電泳結(jié)果第一塊膠孔號12345678樣品MarkerCross-link(ours)Cross-linkconrolboiledCross-link(別組的)Cross-lin