分子雜交和印跡技術(shù)

1、關(guān)于分子雜交與印跡技術(shù)第一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、變性與復(fù)性 （一）變性 1、定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理第二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。第三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低 密度增加

2、紫外吸收值增加第四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4、DNA變性曲線 AT區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈 階梯式曲線第五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3融解溫度：定義：在DNA熱變性時，其A260的升高達(dá)最大值一半時的溫度。第六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷

3、酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子第八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dC dt=K2C2（1）將（1）積分C Co 1 1+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（2）式中的 為1 21 2 1 1+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢C Co（3）1 K2Cot1/2=第九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、分子雜交

4、將任何具有互補核苷酸順序的兩條單鏈核酸分子放入同一個反應(yīng)體系，兩條互補鏈可通過復(fù)性重新締合形成雙鏈，這一過程成為核酸分子雜交。第十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、探針（一）探針的種類 基因組DNA探針 cDNA探針 RNA探針 寡核苷酸探針探針：是指帶有標(biāo)記物的、能與被檢測的核酸片段互補的一段已知核酸片段。第十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二） 探針的制備方法制備方法： (1) DNA重組技術(shù) (2) PCR擴(kuò)增 (3) 化學(xué)合成第十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月合成寡核苷酸探針注意原則(1) 長度（50-300 bp); (2) G:C對含量40%

5、-60%；(3) 探針內(nèi)避免互補；(4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) 與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列 相同，最好不用。第十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）標(biāo)記物 1.想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性： 高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性第十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 標(biāo)記物種類 核素標(biāo)記物：32p、35s、3H 非核素標(biāo)記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光

6、， 如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光 第十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時使 核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中， 3H-尿苷可摻入到RNA中 第十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月體外標(biāo)記法： 化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸 摻入到探針上第十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶促標(biāo)記法1.切口平移法（nick trans

7、lation)1、利用DNase I在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中第十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2.隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補。 另一單鏈DNA模板同樣合成一條

8、新的完全互補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中第二十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月隨機引物法所具有的優(yōu)點：1、能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/gDNA以上4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記第二十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3. PCR標(biāo)記法：將標(biāo)記的核苷酸作為PCR反應(yīng)的底物，以待標(biāo)記的DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中第

9、二十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、影響雜交的因素 1、探針分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜 交效率第二十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、溫度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5 第二十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、離子強度： （1）低鹽濃度時雜

10、交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 第二十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68雜交 第二十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度 （2）復(fù)性速率與反應(yīng)體

11、系中核酸復(fù)雜性成反比 （3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性 第二十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月6、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉 第三十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、應(yīng) 用1.檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系；2.用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。 第三十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月按待測核酸是否固定在固

12、相支持物上分： 固-液相雜交印跡雜交原位雜交液相雜交按照雜交分子特性分DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交蛋白質(zhì)雜交第二節(jié) 核酸分子雜交的方法第三十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、Southern印跡雜交此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。第三十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術(shù)流程第三十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）待測核酸樣品的制備

13、1、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段第三十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）待測DNA樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢,小分子DNA泳動快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記 第三十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 第三十七張，

14、PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程第三十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能 非特異吸附少第三十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共

15、價結(jié)合；對不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低第四十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、Southern印跡的常用方法 （1）毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上第四十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月。第四十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳

16、作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。第四十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。第四十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 （五）Southern雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA探針與

17、膜上的待測DNA雜交 雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 第四十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針第四十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析第四十九張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同 2、

18、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣品為總RNA或mRNA第五十張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡與Southern 印跡的不同點 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA第五十一張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 Western印跡雜交 將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”

19、結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。第五十二張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀 3、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量第五十三張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月五、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交；根據(jù)雜交物分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交。第五十四張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 保

20、持組織細(xì)胞的形態(tài) 對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定 2、雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：第五十五張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理 去垢劑（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落第五十六張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）探針的選擇與標(biāo)記 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為50300bp ,有時達(dá)1.5kb 放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察第五十七張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）雜交 雜交液體積?。?020l cDNA和RNA探針雜交溫度約為50 雜交時間:DNA探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使DNA變性 沖洗溫度一般 不超過50 第五十八張，PPT共六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）雜交結(jié)果檢測 所