NF-κB途徑在舒林酸促人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡中的作用

1、NF-B路子正在舒林酸促人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡中的做用蔡黑星，墨祖安，墨正春【摘要】目的探求核果子BNF-B路子正在舒林酸促人胃癌SG-7901細(xì)胞凋亡中的做用。要收體中做育人胃癌SG-7901細(xì)胞，舒林酸(0.1、0.3、0.6、1.2、2.4l/L)做用后，蘇木粗-伊黑染色、電鏡沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察藥物做用后細(xì)胞形狀教變革，免疫組化、estern-blt要收檢測(cè)藥物對(duì)人胃癌SG-7901細(xì)胞核果子BNF-B、bl-2、bax卵黑表達(dá)的影響。成果蘇木粗-伊黑染色檢測(cè)成果暗示舒林酸抑造腫瘤細(xì)胞逝世少，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮、核碎裂、染色量邊散等凋亡及壞逝世的形狀教暗示；電鏡下可看到染色量邊散

2、、凋亡小體；免疫組化、estern-blt成果暗示舒林酸做用48h祖先胃癌SG-7901細(xì)胞NF-B、bl-2表達(dá)緩緩降降，bax表達(dá)緩緩上降，具有劑量依好性。NF-B與bl-2卵黑表達(dá)率之間具有閉連性r=0.8465，P0.01。結(jié)論舒林酸可以增進(jìn)人胃癌SG-7901細(xì)胞凋亡，NF-B路子正在舒林酸增進(jìn)胃癌SG-7901細(xì)胞凋亡中闡揚(yáng)部門(mén)做用?！鹃]鍵詞】胃癌；非甾體類(lèi)抗炎藥；舒林酸；核果子B；bl-2；baxAbstrat:bjetiveTinvestigatetherlefNF-Bpathayfsulinda-induedapptsisinhuangastriarinaSG-7901ell

3、s.ethdsSG-7901ellsereinubatedandtreatediththedifferentnentratinsfsulinda(0.1,0.3,0.6,1.2,2.4l/L),anderethenunderentheatxylin-esine(H-E)stainingfrbservatinfytrphlgialhangesunderthelypusptialirspeandtransissineletrnirspe.Iunhistheialethdandestern-bltanalysisereeplyedtinvestigatetheeffetfsulindantheexp

4、ressinfNF-B,bl-2andbaxfhuangastriarinaSG-7901ells.ResultsHEstainingshedthatsulindauldinhibitthegrthfturells,iththerphlgialpresentatinsasapptsisandnersisinludingpyknsis,karyrrhexisandhratinresentfratin,et.Byeletrnirspy,ellsalshadappttiharateristisinludinghratinresentfratinandappttibdy.Iunhistheistrya

5、ndestern-bltassayresultsshedthat48hursaftersulindaadinistratin,theexpressinfNF-B,bl-2andbaxgraduallydereased,hilethelevelfbaxprtEingraduallyinreased,inadsedependeneanner.ThereasapsitiverrelatinbeteentheexpressinfNF-Bandbl-2.nlusinSulindaanindueapptsisviaNF-BpathayingastriarinaelllineSG7901.Keyrds:ga

6、striarina;NSAIDs;sulinda;NF-B;bl-2;bax研討表黑非甾體類(lèi)抗炎藥NSAIDs可以經(jīng)由過(guò)程對(duì)環(huán)氧化酶2X-2的間接抑造做用及由此惹起的前線腺素PGs天逝世淘汰而闡揚(yáng)抗腫瘤做用1。同時(shí)有研討表黑NSAIDs可以經(jīng)由過(guò)程核果子B(nulearfatr-kappaB,NF-B)、過(guò)氧化物酶體刪逝世物激活受體PPAR等非X-2依好性路子闡揚(yáng)抗腫瘤做用2-3，但是對(duì)此的研討成果其真沒(méi)有同等。本嘗試旨正在沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察舒林酸做用于人胃癌SG-7901細(xì)胞后NF-B路子正在其促細(xì)胞凋亡中的做用。1材料戰(zhàn)要收1.1材料及儀器舒林酸、RPI1640做育液購(gòu)自好國(guó)Siga公司，

7、無(wú)收本體小牛血渾購(gòu)自杭州四季青逝世物妙技材料公司。人胃癌SG-7901細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。NF-Bs-8008、bl-2(s-492)、bax(s-493)抗體均為Santaruz公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京中杉試劑。舒林酸用兩甲基亞砜DS消融后配成1.2l/L的儲(chǔ)蓄液，嘗試時(shí)用RPI1640液稀釋至所需濃度。1.2嘗試要收與SG-7901細(xì)胞接種于96孔做育板，每孔1104個(gè)細(xì)胞，置37、52及飽戰(zhàn)干度前提下，待24h細(xì)胞揭壁逝世少后，換進(jìn)露有藥物舒林酸的做育液，使舒林酸末濃度別離為0.1、0.3、0.6、1.2、2.4l/L，并設(shè)有陽(yáng)性比較組舒林酸0l/L、陽(yáng)性比較組逆鉑10g/L，每組設(shè)1

8、2個(gè)復(fù)孔，反復(fù)4板，別離做育至24、36、48、60h時(shí)，每孔參減5g/L的TT液40l，繼絕做育4h后移除做育液，參減200lDS振蕩混勻，酶標(biāo)儀492n處測(cè)定光稀度D，策畫(huà)抑造率，抑造率=1-D給藥組/D陽(yáng)性比較組100%。沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察將SG-7901細(xì)胞稀釋為1108個(gè)/L，每孔5l接種于6孔做育板，每做育孔安排曲徑12經(jīng)多散好氨酸處置懲獎(jiǎng)的無(wú)菌蓋玻片，置37、52及飽戰(zhàn)干度前提下，待24h細(xì)胞揭壁逝世少后，吸除做育液，別離參減末濃度為0.1、0.3、0.6、1.2、2.4l/L的舒林酸，設(shè)陽(yáng)性比較組及陽(yáng)性比較組,每組仄止3個(gè)樣本。經(jīng)由過(guò)程光教隱微鏡沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗

9、觀察細(xì)胞形狀教改動(dòng)，同時(shí)正在24、36、48、60h后將做育板中附有SG-7901細(xì)胞的蓋玻片與出，PBS沖刷，10中性甲醛結(jié)實(shí)5in，蘇木粗-伊黑染色其真沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察形狀教改動(dòng)。沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察將SG-7901細(xì)胞稀釋為1108個(gè)/L，按每瓶10l接種于50l做育瓶，置于37、52及飽戰(zhàn)干度前提下，24h細(xì)胞揭壁逝世少后，棄做育液，參減露有舒林酸藥物的做育液，使其末濃度別離為0.3、0.6、1.2l/L，設(shè)坐陽(yáng)性比較，每組3個(gè)仄止樣本。繼絕做育48h后與出，0.25%胰酶消化，離心搜集細(xì)胞，2戊兩醛結(jié)實(shí)細(xì)胞，環(huán)氧樹(shù)脂821包埋，造做超薄切片(60n)后醋酸單氧鈾戰(zhàn)枸櫞酸鉛染色，透射電

10、鏡停頓形狀教沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察。將SG-7901細(xì)胞稀釋為1108個(gè)/L，每孔5l接種于6孔做育板，每做育孔安排曲徑12經(jīng)多散好氨酸處置懲獎(jiǎng)的無(wú)菌蓋玻片6片，置37、52及飽戰(zhàn)干度前提下，待24h細(xì)胞揭壁逝世少后，吸除做育液，別離參減舒林酸末濃度為0.3、0.6、1.2l/L及0l/L陽(yáng)性比較的RPI1640做育液，每組6個(gè)仄止樣本。繼絕做育48h與出玻片，PBS沖刷，10中性甲醛結(jié)實(shí)5in,安排于37恒溫箱2h后與出，采納PerVisin兩步法獨(dú)霸步伐按試劑闡收書(shū)停頓免疫組化染色,檢測(cè)藥物做用前后NF-B、bl-2、bax表達(dá)的改動(dòng)。成果斷定：NF-B、bl-2、bax皆為胞量著色，胞量呈現(xiàn)

11、棕色或棕褐色顆粒斷定為陽(yáng)性細(xì)胞，下倍鏡下沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察10個(gè)下倍視家，策畫(huà)陽(yáng)性細(xì)胞占部分細(xì)胞的比例。將SG-7901細(xì)胞稀釋為1108/L，按每瓶10l接種于50l做育瓶，做育24h細(xì)胞附壁后，倒失降做育液，參減露有舒林酸藥物的做育液，使其末濃度別離為0.3、0.6、1.2l/L，并設(shè)坐陽(yáng)性比較，每組3個(gè)仄止樣本。繼絕做育48h后與出，0.25%胰酶消化，離心搜集細(xì)胞，PBS洗濯3次。細(xì)胞超聲破壞機(jī)破壞細(xì)胞后搜集上渾做為細(xì)胞總卵黑，并用考馬斯明藍(lán)卵黑定量試劑盒停頓卵黑定量。與必然量的卵黑量樣品與2SDS上樣緩沖液100l/LTris堿、200l/LDTT、4SDS、0.2%溴酚藍(lán)、20苦油

12、混淆，按每泳講20g減載于SDS凝膠電泳樣品孔中；100V電泳至溴酚藍(lán)達(dá)分散膠，減年夜電壓至200V，曲至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底部。半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，3%牛血潔白卵黑啟鎖，別離參減11000稀釋的鼠抗NF-B、兔抗bl-2、兔抗bax抗體，4孵育留宿，參減兩抗，室溫孵育2h，NBT/BIP隱色沒(méi)有俗觀沒(méi)有俗觀察成果。1.3統(tǒng)計(jì)教處置懲獎(jiǎng)用Stata10.0硬件停頓數(shù)據(jù)處置懲獎(jiǎng)，數(shù)據(jù)用s暗示，2組間沒(méi)有同采納t檢驗(yàn)，多樣本兩兩比較采納Sheffe法闡收組間沒(méi)有同，閉連性闡收采納Spearan等級(jí)閉連檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：0.05。2成果2.1SG-7901細(xì)胞逝世少抑造狀況TT檢測(cè)成果暗示：舒林酸可以

13、抑造人胃癌SG-7901細(xì)胞刪殖，其抑造做器具有隱著的劑量依好性。睹表1。表1沒(méi)有同濃度舒林酸正在沒(méi)有同工夫?qū)G-7901細(xì)胞的抑造做用略2.2形狀教改動(dòng)跟著給藥濃度的刪減及給藥工夫的延少，SG-7901細(xì)胞緩緩變的希偶，舒林酸下濃度組細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮、核碎裂、染色量邊散等凋亡及壞逝世的形狀教暗示,電鏡下可染色量邊散及凋亡的小體等凋亡的形狀教暗示。睹圖1。2.3NF-B、bl-2、bax表達(dá)的改動(dòng)及其閉連性成果暗示舒林酸做用48h祖先胃癌SG-7901細(xì)胞NF-B、bl-2表達(dá)緩緩降降，bax表達(dá)緩緩上降；舒林酸0.6、1.2l/L組與陽(yáng)性比較組比較，沒(méi)有同有統(tǒng)計(jì)教意義P0.05表2，圖2。由

14、estern-blt成果可睹，跟著藥物濃度的降低,NF-B、bl-2卵黑表達(dá)程度緩緩消沉，bax表達(dá)緩緩降低圖3。表2舒林酸做用48h后NF-B、bl-2、bax陽(yáng)性細(xì)胞比例(略)刪減均緩緩降降，二者之間具有閉連性r=0.8465；P0.01。3會(huì)商N(yùn)F-B為一轉(zhuǎn)錄果子家屬，最常睹的是以p50/p65同兩散體形式存正在于細(xì)胞量中。一般形狀下，NF-B與其調(diào)節(jié)卵黑IB-連開(kāi)后以非活性形式存正在于細(xì)胞量中，正在IB激酶IKK做用下，IB-可收逝世32、36位絲氨酸磷酸化而降解，并與NF-B分散，此時(shí)NF-B可以轉(zhuǎn)位進(jìn)進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)與靶基果啟動(dòng)子連開(kāi)，活絡(luò)引誘靶基果RNA的分解，參減感染、炎癥、免疫反響

15、的調(diào)節(jié)。近去研討表黑，NF-B借與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞分化等腫瘤收逝世、浸潤(rùn)戰(zhàn)轉(zhuǎn)移歷程存正在粗細(xì)閉連4-5。正在人類(lèi)黑血并胃癌、肝癌、年夜腸癌、卵巢癌、膀胱癌等很多惡性腫瘤中NF-B呈非?；罨螤?。至于其做用機(jī)造，研討暗示NF-B可以上調(diào)包羅粘附份子(VA-I、IA-1、ELA-I)、細(xì)胞中基量卵黑水解酶(uPA、P-2)戰(zhàn)血管內(nèi)皮逝世少果子VEGF等多種基果的表達(dá)，從而增進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移6-7。NF-B借可以經(jīng)由過(guò)程多條路子參減腫瘤凋亡的調(diào)控，如調(diào)節(jié)bl-2、bax、IAP家屬、aspase、ylinD等基果的表達(dá)，那些基果產(chǎn)品可互相協(xié)同并正在晚期抑造細(xì)胞凋亡，從而增進(jìn)細(xì)胞無(wú)量刪殖，

16、減快腫瘤構(gòu)成8。NF-B與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞分化等腫瘤的收逝世、浸潤(rùn)戰(zhàn)轉(zhuǎn)移歷程存正在粗細(xì)閉連，提醒其可以成為一個(gè)新的腫瘤防治靶面。引誘腫瘤細(xì)胞的凋亡正在NSAIDs抗腫瘤做用中具有緊張做用。塞責(zé)NSAIDs的促凋亡機(jī)造至古其真沒(méi)有非常清楚，年夜要與NSAIDs下調(diào)bl-2、FAL4，上調(diào)-y、Par-4表達(dá)及激活aspase-3酶有閉9；但haraes等10采納RNA干擾妙技去除HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源性X-2表達(dá)后并已創(chuàng)造bl-2表達(dá)及aspase-3活性的改動(dòng)，表黑NSAIDs對(duì)bl-2的抑造做用可以經(jīng)由過(guò)程非X-2路子闡揚(yáng)做用；進(jìn)而ali-Juge等11研討暗示NS-398X-2挑選性抑造劑可以經(jīng)由過(guò)程抑造NF-B活性及降低bax/bl-2比值從而影響凋亡基果的表達(dá)；以上研討均提醒NSAIDs可以經(jīng)由過(guò)程多種路子闡揚(yáng)促腫瘤凋亡