酵母胞外多糖的液體發(fā)酵胞外多糖的提取與測定

1、實驗二、三 斯達(dá)油脂酵母胞外多糖發(fā)酵、 提取及測定一 教學(xué)要求 了解微生物液體培養(yǎng)法。 了解微生物胞外多糖的發(fā)酵及制備過程。二 實驗原理 微生物多糖從其在細(xì)胞中的分布可分為細(xì)胞外多糖、細(xì)胞壁多糖和細(xì)胞內(nèi)多糖。細(xì)胞外多糖（EPS）是指分布于細(xì)胞壁之外，以莢膜的形式附到細(xì)胞壁上或以粘液的形式分泌于胞外環(huán)境的同多糖或異多糖。EPS不但對微生物具有重要的生物學(xué)作用，而且在食品、化妝品、造紙、紡織印染和石油開采等工業(yè)上有廣泛的用途。 1 許多微生物均能產(chǎn)生胞外多糖，但只有在合適的培養(yǎng)條件下才能大量產(chǎn)生積累該產(chǎn)物。本實驗以斯達(dá)油脂酵母為生產(chǎn)菌種，選用高碳氮比的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及高通氣量等有利于菌株多糖合成的

2、培養(yǎng)條件進(jìn)行EPS發(fā)酵。 本實驗多糖的定量測定采用苯酚硫酸法。多糖在濃硫酸作用下生成糠醛，糠醛能與酚類化合物作用生成有色物質(zhì)，在490nm處有最大吸收值，且顏色深淺在一定范圍內(nèi)與糖含量呈線性關(guān)系，因此可采用分光光度法進(jìn)行定量測定。 2三 材料與器材菌種：斯達(dá)油脂酵母（Lipomyces starkeyi）2. 1390.試劑： （1）無機鹽溶液：MgSO4.7H2O 0.4 % ， MnSO4.H2O 0.2 %， FeSO4.7H2O 0.2 % ，NaCl 0.2 %（2）種子培養(yǎng)基：蔗糖2%，酵母膏0.5%， pH6.5.（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖8%，蛋白胨0.3% ，K2HPO4 0

3、.35% ，KH2PO4 0.35% ，無機鹽溶液5mL/L pH6.5.種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為250 mL 三角瓶30 mL，8層紗布塞于瓶口，并用牛皮紙包扎，培養(yǎng)基121 滅菌20 min。3四 操作步驟1、胞外多糖發(fā)酵 斜面培養(yǎng) 將斯達(dá)油脂酵母2.1390菌株接在斜面培養(yǎng)基上,28培養(yǎng)48h 。 種子培養(yǎng) 在種子培養(yǎng)基中接入斜面菌種一環(huán)，用8層紗布展平包扎于瓶口，然后置28搖床（200 r/min）振蕩培養(yǎng)36 h。 多糖發(fā)酵 在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子液1.5ml，用8層紗布展平包扎于瓶口后，放置28搖床（200 r/min）振蕩培養(yǎng)108 h 。42、多糖的提取及測定 粗多糖的提取

4、及測定樣品液的制備 發(fā)酵液用蒸餾水稀釋3倍，3500r/min離心15min除菌體。取上清液1ml，調(diào)pH至6.0，加95%乙醇3ml，氯化鉀飽和液1滴，混勻。靜置讓多糖充分沉淀，然后在3500r/min離心10min，棄上清液。沉淀用75%乙醇洗至無還原糖反應(yīng)，經(jīng)洗滌后的沉淀即為胞外粗多糖。將其溶于水并稀釋至適當(dāng)濃度（樣品液）。 5 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支干凈試管，分別加入100g /ml甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，不足1ml管用蒸餾水補足至1ml，各管再加6%苯酚溶液1.0ml ，搖勻，再加入濃硫酸5.0ml,混勻靜置10min后在2530水浴中放置20min，取出。用1cm 玻璃吸收池，以空白管溶液為參比，在波長490nm處依次測定各管溶液的光密度值（OD）。 樣品測定 取樣品液1.0ml，同制作標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作。 6四、注意事項1、注意無菌操作2、多糖測定時，注意控制好供測樣品的