實驗數(shù)據(jù)開題

1、研究生：石成奎 導(dǎo) 師：王 俊 副教授 謝俊霞 教 授 專 業(yè)：神經(jīng)生物學(xué) 時 間：2015-12-22 -突觸核蛋白（-synuclein）在小膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝中的作用及其分子機制1 研究背景2 立題依據(jù)3 技術(shù)路線4 實驗?zāi)繕?biāo)目 錄1 研究背景帕金森?。≒arkinsons disease, PD）帕金森病是一種目前無法治愈的神經(jīng)退行性疾病，其特點是錯誤折疊和聚集-突觸核蛋白，通常被稱為突觸核蛋白病病理特征： 黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，以及出現(xiàn)異常聚集的-突觸核蛋白構(gòu)成的路易氏小體。臨床表現(xiàn)：靜止性震顫 肌僵直 運動不能 姿勢反射障礙1-突觸核蛋白（-synuclein）：是一個由

2、140 個氨基酸組成的可溶性蛋白，認(rèn)為在突觸囊泡釋放和轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)起著重要的作用，還與脂肪酸結(jié)合，和神經(jīng)元存活有關(guān)。雖然神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)-突觸核蛋白異常聚集通常伴有鐵的沉積，說明鐵與-突觸核蛋白聚集之間存在一定聯(lián)系。但是，目前研究仍然沒有對于三種狀態(tài)-突觸核蛋白的毒性形成共識，阻礙我們將該蛋白作為干預(yù)治療PD的目標(biāo)。1 研究背景22 立題依據(jù)-突觸核蛋白具有單體、寡聚體、多聚體三種形態(tài)。在腦內(nèi)，主要由神經(jīng)元分泌并釋放進(jìn)入胞外空間，并可被相鄰的神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞及少突細(xì)胞吞噬。已有研究組測試了神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞對胞外聚集化的-突觸核蛋白的內(nèi)吞能力，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對-突觸核蛋白的

3、內(nèi)吞能力是最強的。32 立題依據(jù)同時研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞有鐵的沉積，下面以小腸鐵轉(zhuǎn)運為例說明-突觸核蛋白是否參與小膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝。42 立題依據(jù) 十二指腸細(xì)胞色素b（Dcytb）是一種鐵還原酶，近年來的研究發(fā)現(xiàn)-突觸核蛋白也是一種鐵還原酶，能將細(xì)胞內(nèi)的Fe3+還原成 Fe 2+。這表明-突觸核蛋白可能作為一種鐵代謝的調(diào)節(jié)蛋白，參與了小膠質(zhì)細(xì)胞鐵的沉積。DMT1-synFe3+Fe2+Fe2+FPN1-synFe3+Fe2+猜 想microglia52立題依據(jù) -突觸核蛋白三種形式具有不同的生物學(xué)功能。其單體可以同多種磷脂發(fā)生作用，寡聚體主要擾亂帶負(fù)電荷的囊泡，而多聚體能夠作用于負(fù)電荷的囊泡和細(xì)胞

4、膜。 已有研究證明寡聚體和多聚體形式的-突觸核蛋白對細(xì)胞毒性作用是通過與細(xì)胞膜相互作用和破壞膜完整性完成的，但是目前研究仍然沒有對三種形態(tài)-突觸核蛋白的毒性強弱達(dá)成共識。因此，確定-突觸核蛋白三種形態(tài)毒性的強弱是必要的。了解哪種形式-突觸核蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運影響最大。63技術(shù)路線 -突觸核蛋白寡聚體的制備1 將100 uM -突觸核蛋白單體溶解于0.01M PBS中（pH 7.0），過濾除菌。將溶液200-300ul裝在Eppendorf管中，在37度恒溫?fù)u床230rpm振蕩孵育。2 Eppendorf管傾斜，振蕩時間應(yīng)大于72-96小時。每天觀察有無沉淀，如果有明顯沉淀，說明有纖維形成，

5、最好在沒有纖維形成前停止。3 Western blot檢測，凝膠的濃度10%。 7 -突觸核蛋白多聚體的制備1.-突觸核蛋白單體（200Mm）溶解在包含50Mm trisHCl（pH值7.5）及150MmKCl中，通過0.22m過濾器過濾除菌。2 600rpm 37C 振蕩4天。3.多聚體15000rpm離心10min，PBS重新懸浮沉淀。重復(fù)兩次。4.電鏡檢測多聚體。3技術(shù)路線8雙擊添加標(biāo)題文字IRPs表達(dá)變化HIF表達(dá)變化DMT1表達(dá)量變化FPN1表達(dá)量的變化鐵轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出變化monomers/oligomers/fibrils小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系培養(yǎng)3技術(shù)路線9monomersoligomersfibrilsBV2小膠質(zhì)細(xì)胞系培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)3技術(shù)路線IRPs表達(dá)變化HIF表達(dá)變化DMT1表達(dá)量變化FPN1表達(dá)量的變化鐵轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出變化-突觸核蛋白抗體10黑質(zhì)上方注射-突觸核蛋白的小鼠動物模型0X-42/DMT1共表達(dá)0X-42/FPN1共表達(dá)鐵水平變化3技術(shù)路線11-突觸核蛋白抗體黑質(zhì)-突觸核蛋白的攝取4實驗?zāi)繕?biāo)1.確定三種形態(tài)-突觸核蛋白（單體、寡聚體、多聚體）的高鐵還原酶活性的大小，確定外源性-突觸核蛋白對小膠質(zhì)細(xì)胞DMT1，F(xiàn)PN1以及IRP1和HIF表達(dá)量的影響及胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出的變化。2.抑制-突觸核蛋白鐵還原酶的活性，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞DMT