Gateway的原理培訓(xùn)講學(xué)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Gateway的原理-Gateway也可以被視為一種克隆操作平臺(tái)：把目的基因克隆到入門載體（EntryVector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（DestinationVector，目的載體）上。Gateway的原理也是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿

2、菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR。這是一個(gè)可逆的過程，如果在一個(gè)噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導(dǎo)下這兩個(gè)新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB和attP位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來。這一過程的方向是受控于兩個(gè)重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。在Gateway系統(tǒng)中,入門載體包含兩個(gè)重組位點(diǎn)序列attL1和attL2，大小均為100bp，中間夾著一個(gè)自殺基因ccdB基因。由于ccdB基因的表達(dá)產(chǎn)物能抑制普通的E.coli生長(zhǎng)，在克隆時(shí)沒有切開或者自身環(huán)化的載體在轉(zhuǎn)化時(shí)不能生長(zhǎng)。在構(gòu)建含目的基因的入門載體時(shí)必須切掉這個(gè)基因，接入目的基因。ccdB基因兩端可

3、以選擇的酶切位點(diǎn)有限（2個(gè)），同時(shí)還必須考慮讀碼框架、啟動(dòng)子、終止密碼等問題，因此Gateway系統(tǒng)提供了5種不同的入門載體以供選擇。需要特別注意的是轉(zhuǎn)化用的菌株必須是不含F(xiàn)附加體的，因?yàn)樗磉_(dá)的一種產(chǎn)物能阻斷ccdB基因，影響篩選結(jié)果。同樣，目的載體（DestinationVector）也必須和Gateway系統(tǒng)配套，即目的載體的表達(dá)調(diào)控元件下游有兩個(gè)重組位點(diǎn)attR1和attR2，大小均為125bp，同樣也夾著一個(gè)ccdB自殺基因。當(dāng)需要將目的基因從入門載體（EntryVector）轉(zhuǎn)移到目的載體（DestinationVector）時(shí)，只要將兩種質(zhì)粒混合（線性化能有效提高重組率），加入含

4、有Int、IHF、Xis等重組因子的LR重組酶混合物，attR2序列和attL2序列發(fā)生重組，生成一個(gè)融合質(zhì)粒。attL1序列再和attR1序列重組，融合質(zhì)粒分解為兩個(gè)新的質(zhì)粒，目的基因與原來位于目的載體上的自殺基因發(fā)生重組置換，得到一個(gè)帶目的基因的目的載體（生成新的重組位點(diǎn)attB1、B2）和帶自殺基因的入門載體（生成新的重組位點(diǎn)attP1、P2）。反應(yīng)過程需要25度保溫1小時(shí)（時(shí)間越長(zhǎng)，重組率越高，特別是較大的質(zhì)粒，反應(yīng)過夜能提高5倍重組效率），蛋白酶K37度處理10分鐘，轉(zhuǎn)化。由于帶自殺基因的載體不能生長(zhǎng)，加上抗生素篩選，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物重組率高達(dá)90%以上。同樣，轉(zhuǎn)化用的菌株必須是不含F(xiàn)附加體

5、的。由于在這個(gè)反應(yīng)中attL1序列只和attR1序列重組，attL2序列只能與attR2序列重組，這個(gè)方向的反應(yīng)稱為L(zhǎng)R反應(yīng)。LR反應(yīng)生成新的位點(diǎn)稱為attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。在一定的條件下，attP和attB序列也能發(fā)生重組，生成attL和attR序列，這個(gè)反向反應(yīng)稱為BP反應(yīng)。當(dāng)用戶得到一個(gè)含目的基因的Gateway表達(dá)載體，希望將目的基因轉(zhuǎn)移到另外幾個(gè)Gateway表達(dá)載體中時(shí)，只要先將目的基因從Gateway表達(dá)載體中轉(zhuǎn)移到入門載體上，在由入門載體轉(zhuǎn)移到其它的表達(dá)載體就行。將含目的基因的Gateway表達(dá)載體（attB1目的基因attB2序列）與帶有

6、attP1-ccdB(自殺基因)-attP2序列的供體載體（pDONR，注意這個(gè)載體不同于入門載體EntryVector）混合，加入含有Int、IHF的BP重組酶混合物，25度保溫1小時(shí)，37度蛋白酶K處理10分鐘，根據(jù)與上面相同的原理，attP和attB序列也能發(fā)生重組，生成帶有目的基因的入門載體（EntryVector）和帶自殺基因的表達(dá)載體。同樣，由于抗性不同以及自殺基因的作用，只有含目的基因的入門載體能被篩選出來。這即是BP反應(yīng)。需要特別注意的是表達(dá)載體如果也是卡那霉素抗性，就必須選擇另外一個(gè)供體質(zhì)粒以便篩選。使用Gateway系統(tǒng)的第一步即為入門載體的構(gòu)建，有以下幾種方法：APCR重

7、組克隆以下列方式合成PCR引物，即GGGG-attB1或者attB2序列（25bp）-基因特異性序列（18到25個(gè)堿基或以上），這樣在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)就可以直接得到兩端帶有attB1/2基因的片斷。將PCR產(chǎn)物直接與上述的供體載體（帶有attP1-ccdB(自殺基因)-attP2序列）混合，加入BP重組混合酶，25度保溫1小時(shí)，再37度蛋白酶K處理10分鐘，即可轉(zhuǎn)化并得到帶有目的基因的入門載體。當(dāng)然，這個(gè)產(chǎn)物最后是需要測(cè)序鑒定的，并且，克隆到入門載體的基因不能表達(dá)，所以不能用抗體篩選檢測(cè)。還有一點(diǎn)值得注意的是，由于attB1的末端（第25個(gè)堿基）是T，所以跟在后面的基因特異性序列的頭兩位堿

8、基不能是AA、AG和GA以免提前出現(xiàn)終止密碼。得到的入門克隆中，目的基因兩側(cè)具有attL重組位點(diǎn)，可以與任何Gateway目的載體進(jìn)行重組。B限制性內(nèi)切酶消化作為PCR克隆的替代方法，有5種Gateway入門載體可以使用傳統(tǒng)的限制酶切和連接的方法產(chǎn)生入門克隆。這些載體配合合適的目的載體，可以用于表達(dá)天然蛋白或帶有N端或C端融合標(biāo)簽的重組蛋白。為了在真核細(xì)胞中有效地翻譯蛋白，所有的5個(gè)Gateway入門載體提供了Kozak序列。此外，pENTR11提供了SD(Shine-Dalgarno)序列，便于在大腸桿菌中有效的翻譯。CGateway改造過的cDNA文庫如果您已經(jīng)有了用Gateway兼容載體構(gòu)建的cDNA文庫，您就可以通過pDONRTM載體和BPClonaseTM酶混合物進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單的重組反應(yīng)，很容易地把單個(gè)克隆轉(zhuǎn)換成Gatew