《衛(wèi)生化學》課件14.第七章_超高效液相色譜法1

1、超高效液相色譜法（UPLC）色譜實驗室的新高度Jorgensen博士和楊百翰大學的M. Lee博士最近都發(fā)表了關(guān)于色譜實驗室未來分析范圍的深刻見解。他們的研究為分離科學描繪了一幅新圖景。通過使用比以前小得多顆粒，使分離過程達到了一個新的終點。范第姆特方程是一個描述線速度與塔板高度（柱效）關(guān)系的經(jīng)驗式。從圖1可以看出，一旦填料的顆粒大小低于2 m，色譜技術(shù)就能達到一個新水平：不僅柱效更高，而且隨著流速的提高不會使柱效降低。如果使用UPLCTM技術(shù)和2 m以下的顆粒，那么即使在較高的線速度下，效率也能得以保持。更短色譜柱和或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和靈敏度，從而使現(xiàn)在有可能充分利

2、用色譜原理進行分離。峰容量被定義為色譜法每單位時間內(nèi)所能分辨的峰數(shù)量。峰容量和分離速度等性能指標得到提高后的色譜法被稱為超高效液相色譜法，或UPLC。圖2說明了當顆粒大小從5 m減小至1.7 m時，增加的峰容量對色譜分離性能的影響。 源于更小顆粒的額外效率可帶來更多的明顯益處。更短的色譜柱或更高的流速加快了速度，同時小顆粒也提高了分辨率。對于任何給定的分離，都可通過調(diào)節(jié)這些變量而達到速度和分辨率的最佳組合該頭發(fā)的直徑約等于12個5 m的顆粒，33個1.7 m的顆粒。圖4顯示出了目前實驗室常用的5 m顆粒與建議用于UPLC柱的更小的1.7 m顆粒的明顯差異。目前，非多孔型1.5 m顆粒已經(jīng)上市。

3、雖然這類顆粒效率較高，但它們的缺點是表面積較小。表面積小會導致載樣量小和保留時間短。為了與HPLC保持相近的保留時間和載樣量，UPLC必須使用多孔型顆粒。UPLC需要一種新穎的耐高壓多孔型顆粒。填充床的均勻性也是至關(guān)重要的；特別是當較短的色譜柱用以保持分辨率的穩(wěn)定，而同時又要達到加快分離速度的目標時。另一項要求是色譜柱的內(nèi)表面必須足夠光滑，以便于填充較小顆粒。應(yīng)重新設(shè)計色譜柱兩端的篩板，使之既能留住小顆粒又能避免堵塞。3 m是15 cm長普通色譜柱顆粒大小的極限。這是在色譜柱達到最佳流速而又不超出市售儀器（使用任何配比的甲醇水混合溶劑）的壓力限制范圍的條件下，運行系統(tǒng)所能使用的最小顆粒大小。（

4、注意：迄今為止，用于HPLC的最小顆粒是0.67 m 為了達到顆粒小、峰容量大的分離效果，需要比目前使用的HPLC儀具有更廣的壓力范圍。在能達到最大效率的最佳流速下，對于10 cm長裝有1.7 m顆粒的色譜柱，計算得出的壓力降是15,000 psi。因此，需要一個能在該壓力下傳送溶劑的泵。 在這些條件下，溶劑的可壓縮性將會變得顯著，特別是在多溶劑和梯度分離條件下。UPLC的溶劑傳送系統(tǒng)應(yīng)不僅僅具有高壓泵抽吸功能，同時在等度和梯度分離模式下使用各種溶劑，溶劑傳送系統(tǒng)必須能抵消溶劑可壓縮性引起的大范圍潛在壓力波動，以實現(xiàn)平穩(wěn)而可重現(xiàn)的流體輸送。普通進樣閥，不論是手動的還是自動的，都不具有極端壓力下

5、的耐用功能。進樣的可重現(xiàn)性和線性的典型性能標準是分析應(yīng)用所需要的為保護色譜柱免受極端壓力波動的影響，進樣過程應(yīng)盡可能排除脈沖干擾。儀器的系統(tǒng)體積要小，以減小所檢測樣品可能的區(qū)帶展寬。在快速進樣循環(huán)中，UPLC能以最大速度、較大的樣品通量進行工作 理論情況下，配備1.7 m顆粒的UPLC系統(tǒng)能產(chǎn)生半峰寬小于1秒的檢測峰。這給UPLC檢測帶來了挑戰(zhàn)。首先，檢測器必須具有較高的采樣速率，以在檢測峰通過時捕捉足夠的數(shù)據(jù)點，從而對分析物的檢測峰進行準確而可重現(xiàn)的識別（和積分）檢測器必須有最小的擴散體積，以確保分離效率不降低。檢測器的光學部件也必須具有能體現(xiàn)UPLC靈敏度優(yōu)勢的性能指標。從概念上講，對于不

6、同的檢測技術(shù)，UPLC檢測的靈敏度應(yīng)是HPLC分離靈敏度的2-3倍（圖5）。例如，質(zhì)譜檢測會極大得益于UPLC的性能特征,使與UPLC相連的質(zhì)譜儀的靈敏度至少提高3倍 在進行高峰容量的色譜分析時，降低分析物的色譜展寬可能有助于提高靈敏度除了化學、泵、進樣器和檢測器之外，還需要對系統(tǒng)進行考慮。系統(tǒng)的體積至關(guān)重要。如果要在色譜分析過程中保持UPLC分離的高性能，則UPLC的系統(tǒng)總體積必須大大低于目前的HPLC系統(tǒng).如：考慮連接管和接頭配件UPLC技術(shù)能實現(xiàn)提高液相色譜速度、分辨率和靈敏度的承諾，為每次分析提供更多的信息；因此，該技術(shù)將會得到實驗室的廣泛認可。超高效液相色譜法（UPLC）相對于高效液

7、相色譜法（HPLC）的優(yōu)勢所在：1.速度超高效液相色譜法（UPLC）采用新型全多孔球形1.7m反相固定相，該固定相是應(yīng)用“雜化顆粒技術(shù)”（hybrid particle technology，HPT）合成的，并由此制備了高柱效的ACQUITY UPLC色譜柱。這使得在常規(guī)高效液相色譜需要30分鐘時間的樣品分析在超高效液相色譜短短為僅需5分鐘，并呈現(xiàn)出色譜柱柱效達20萬塊/m理論塔板數(shù)的超高柱效。 2.靈敏度我們知道UPLC色譜柱中使用的是1.7m固定相，分離獲得的色譜峰半蜂寬小于1s，這就對檢測器的要求是極高的。AQUITY UPLC使用采樣速度達40點/s，池體積僅為500nL（約為HPLC

8、池體積的1/20）的新型光導纖維傳導得流通池，當光束通過光導纖維進入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全析射特征，不損失光能最，而使檢測靈敏度比HPLC增加23倍。光源可使用可變波長的紫外光或二極管陣列系統(tǒng)。 3.自動化對于UPLC的進樣系統(tǒng)，常規(guī)的手動進樣閥和自動進樣閥都不能滿足系統(tǒng)需求了。在UPLC中為保護色譜柱不受極端高壓力波動的影啊，進樣過程應(yīng)當相對無壓方波動，進樣系統(tǒng)的死體積必須足夠小，以降低樣品譜帶的擴展。 UPLC的自動化進樣器的設(shè)計有了新突破：針內(nèi)針進樣探頭（XYZZ）為高速進樣機械裝里，可快速進樣。針內(nèi)針的含義是使用液相色譜管路（PEEK材料）充當進樣針以減少死體積，而“外針”是

9、一小段硬管，用來扎破樣品瓶蓋；壓力輔助進徉。為了降低進樣時的交叉污染，采用一強、一弱的雙溶劑的進樣針清洗步驟，這兩種洗針溶劑需同時得到良好的脫氣。 此技術(shù)可保證可靠、重現(xiàn)的進樣；在自動進樣器內(nèi)，可安置96位或384位樣品盤。每個位置可放置2或4mL樣品瓶。新型的樣品組織器可接受21個樣品盤的編程。 與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白質(zhì)、肽、代謝組學分析及其它一些生化領(lǐng)域里將會得到廣泛應(yīng)用。另外，在天然產(chǎn)物的分析方面，使用UPLC與質(zhì)譜檢測器連接，會對天然產(chǎn)物分析，特別是中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個極的促進。 在提到“蛋白組學”或“

10、代謝組學”時，與沒有“組”的差別從分析的角度說就是樣品量極大，需要在短時間分析成千上萬的樣品。UPLC不損失分離度的高速度優(yōu)點在里就能充分體現(xiàn)。多生化樣品及天然產(chǎn)物都十分復(fù)雜， Waters UPLC 超高效液相色譜超高效液相色譜儀 Nexera UHPLC LC-30A 通量最大化：1、 超高速/超高分離度分析承受最大壓力高達130MPa。2、 超快速進樣通過重疊進行，使進樣時間最短，每次進樣僅需10秒。3、 樣品容量最大化Nexera換架器，可處理多達4600種樣品；多路系統(tǒng) （MPX）。 性能最優(yōu)化：1、 微量分析時，交叉污染最小化以最小的接觸面積通過進樣針；可以使用多種溶劑（最多4種）

11、徹底清洗樣品流路和進樣針表面。 2、 以最小的體積，精確并準確地進樣使用高分辨率計量泵直接進樣；計量泵獨立于流路之外。3、 在超快速條件下，保證良好的梯度重現(xiàn)性高分辨率梯度控制；MiRC混合器的有效混合機制 4、 適用于UHPLC的均衡色譜柱加熱IHB控制的柱間溫度分布最小化；通過微體積預(yù)熱器，有效預(yù)熱。擴展性最大化1、 可升級的UHPLC組件設(shè)計通過組合常用的HPLC組件，可以自由地配置系統(tǒng)。2、 使用自動進樣器，對樣品進行自動前處理可以進行柱前衍生、內(nèi)標物添加以及樣品稀釋。 3、 高溫分析柱溫最高達150；高溫促使新技術(shù)的應(yīng)用，比如綠色色譜法（Green LC）。 4、 高速LCMS分析與

12、超快速LCMS、LCMS-2020相結(jié)合。頭發(fā)中煙堿和可替寧的超高效液相色譜測定煙堿( nicotine)是煙草中的主要生物堿, 是導致吸煙成癮的物質(zhì)動因, 也是評價人體攝入煙草煙霧的常用指標?？商鎸幨菬焿A在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物, 是評價煙草煙霧攝入量的生物標志物 測定發(fā)樣中煙堿和可替寧的含量水平可以反映人群較長期對煙草煙霧的暴露情況, 可以為流行病學調(diào)查提供定量依據(jù), 用于評價煙草煙霧對人體健康的影響。本文了UPLC法測定主動吸煙人群和被動吸煙人群頭發(fā)中的煙堿和可替寧試驗日本島津超快速液相色譜儀Prominenece UFLC快速分析作為重要技術(shù)課題一直以來都在使用，但伴隨LCMS的迅速普及，

13、提高性價比成為迫在眉睫的問題，成為了加緊快速化的重要因素。快速分析即縮短分析時間，通常通過縮短色譜柱或提高流動相的流量來達到目的使用小粒徑的填料 通過這個方法將使快速分離成為可能。但是，由于色譜柱里流動阻力的增加，儀器各部件和色譜柱所承受的壓力也將顯著地增加高溫分離 較高的溫度可以加速物質(zhì)的擴散，同時可以減小色譜柱里的流動阻力，也使得快速分離成為可能。高溫分析在降低柱壓方面很有效，但是高溫引起色譜柱的劣化、導致樣品分解等不足在應(yīng)用時需要引起注意。UFLC通過以下特性支持快速分析：小柱管和小體積的流通池降低了柱外峰展寬效應(yīng)。使用2.2m顆粒大小的色譜柱自動進樣器實現(xiàn)10秒鐘10l的超快速進樣支持

14、高達85的高溫分析。溫度與快速分析：隨著柱溫升高，理論塔板數(shù)增加，柱效增高，柱壓降低。 溫度對化合物的影響：高溫分析在降低柱壓方面很有效，但是高溫引起色譜柱的劣化、導致樣品分解等不足在應(yīng)用時需要引起注意。高溫分析只是作為快速分析的輔助手段加以運用。具備高采樣頻率的檢測器，可以實現(xiàn)快速的數(shù)據(jù)獲取而不會丟失信息。專門的色譜方法轉(zhuǎn)換軟件，使常規(guī)色譜條件轉(zhuǎn)換為UFLC條件簡單易行，保證分析方法的通用性。 快速分析的重現(xiàn)性 在快速分離中要取得成分保留時間的重現(xiàn)性要比常規(guī)分析中更加困難。保留時間的重現(xiàn)性（RSD）和時間的平方根成反比增大，所以需要比常規(guī)分析更為嚴格的送液性能。Prominence UFLC

15、可以保證送液分辨率 3nL/min的微沖程送液、梯度送液時控制響應(yīng)為0.1秒的卓越送液能力，可以發(fā)揮極為優(yōu)越的保留時間重現(xiàn)性。 什么是高通量 快速液相色譜的目標就是高通量，也就是說每天或每小時有更多的樣品被分析。為了實現(xiàn)高通量，不僅要縮短單個樣品分析時間，而且整個循環(huán)進樣和分析時間也必須優(yōu)化。追求快速化的本意不僅是縮短分析時間，而且是縮短分析周期。Prominence UFLC的樣品注入速度為10秒，使得分析周期得以大為縮短。PTC衍生氨基酸的UFLC分析多環(huán)芳烴(PAHs)的UFLC分析 2004年waters推出了UPLC（UltraPerformance LC）2005年jasco推出了XPLC2006年shimadzu推出了UFLCthermo fisher推出了UHPLC超高效液相色譜 (Ultra-High Per