葉綠素測(cè)定分光光度法

1、葉綠體色素含量的測(cè)定一一分光光度法葉綠體色素含量的測(cè)定一一分光光度法葉綠體色素溶液各組成成分在可見光 譜中具有不同的特征吸收峰。因此，應(yīng)用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下所測(cè)定的 吸光度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式即可計(jì)算出色素溶液中各色素濃度，不同溶劑所提取的色 素吸收光譜有差異，因此，應(yīng)使用不同的計(jì)算公式。葉綠體色素的提取常用丙酮和乙醇有機(jī)溶劑。葉綠體色素80 %丙酮提取液中 葉綠素a和b及類胡蘿卜素分別在663nm、646nm和470nm波長(zhǎng)下有 最大吸收峰，而95 %乙醇提取液中它們則在665nm石49nm和470nm波 長(zhǎng)下具有最大吸收峰，據(jù)此所測(cè)得的吸光度值代人不同的經(jīng)驗(yàn)公式（見結(jié)果計(jì) 算），計(jì)算出葉

2、綠體色素丙酮（或乙醇）提取液中葉綠素a和b的濃度及其 葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度，并依據(jù)所使用的單位植物組織（鮮重、干 重或面積），求算出色素的含量。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛确▽?duì)植物葉綠體色素提取液中葉綠素a和b的濃度及其葉綠素 總濃度和類胡蘿卜素的總濃度測(cè)定與計(jì)算方法，以及植物材料中各種色素含量的 求算方法。器材和試劑.植物材料 新鮮（或烘干）植物葉片，如菠菜葉片等。.實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)、天平、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、棕色容量瓶、吸 水紙、擦鏡紙和滴管。.實(shí)驗(yàn)試劑80 %丙酮（或95 %乙醇）、石英砂和碳酸鈣粉。操作步驟.色素的提取稱取新鮮（或干材料）的洗凈擦于的植物葉片0.5g （或一定

3、面積），去中脈、 剪碎后放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml80 %丙酮（或95 %乙 醇），冰浴中研磨至組織變白，再加丙酮10ml，研成勻漿，暗處靜置約10m in。將提取液過濾到50 ml棕色容量瓶中，用丙酮反復(fù)沖洗研體與研棒數(shù)次并用 少量丙酮反復(fù)沖洗濾紙和殘?jiān)敝翢o綠色為止，以使色素全部轉(zhuǎn)移入容量瓶。最后用丙酮定容至50 ml ,搖勻，并保存于暗處備用待測(cè)。每一材料要做3 5份，重復(fù)提取測(cè)定，以期獲得準(zhǔn)確的色素含量值。.吸光度的測(cè)定將色素提取液重新混勻。取光徑1cm的比色杯，注入上述色素丙酮提取液，以80 %丙酮注入另一同 樣的比色杯內(nèi)作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)663、646和470

4、nm下測(cè)定吸光度（、和）。.結(jié)果計(jì)算依據(jù)下列丙酮（或乙醇）提取液中色素濃度計(jì)算公式，分別計(jì)算出葉綠素a上 的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的濃度。80 %丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式：12.214-2.81446C20.1346 - 5.034% = 4 + 閂=17.32 編7.18&必= （1000A70-3.27Ca-104CJ/22995 %乙醇提取液中色素濃度計(jì)算公式：/ =13.9沮兌-6.8御心烏= 2496編廠7處盛 = + =18.08-6.63= （100070 - 2.05-114.8）/245式中，、和分別為葉綠素a和b的濃度及其葉綠素總濃度，mg L -1 ；為類胡

5、蘿卜素的總濃度，mg L -1 ；&矛 -665 -646 *侮和470為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)663nm、665nm、646nm、649nm和470 nm下的吸光度。再按下式求算植物組織中單位鮮重(或十重、面積)各色素的含量(mg g -1或 mg m -2)。葉綠體色素的含量=色素的濃度出 S) X提取液體積(*稀釋倍數(shù)樣品鮮重f或干重、面積.占或狀少注意事項(xiàng).光對(duì)葉綠素有破壞作用，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在弱光下進(jìn)行，且應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)研 磨。.色素提取液若混有其他物質(zhì)而造成渾濁，將影響吸光度的測(cè)定，應(yīng)重新過濾 或離心。.色素吸光度測(cè)定前，應(yīng)按儀器說明及標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a、b對(duì)分光光度計(jì)的 波長(zhǎng)進(jìn)行校正，否則影印葉綠素含量的測(cè)定精度。思考題1葉綠素a和b在紅光和藍(lán)光區(qū)都有吸收峰，可否在藍(lán)光區(qū)的吸收峰波長(zhǎng)下 進(jìn)行葉綠素a和b的定量分析，原因何在？2解釋用分光光度法測(cè)定葉綠素含量時(shí)首先標(biāo)定儀器波長(zhǎng)精確度的原因，試比較 儀器標(biāo)定與未標(biāo)定的測(cè)定結(jié)果的誤差。探索性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用已掌握的植物葉綠體色素的提取、分離和含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法，取植物和植物（或陰生植物和