【課件】生化分析儀檢測原理

1、臨床生化檢驗(yàn)反應(yīng)原理及報(bào)告審核檢驗(yàn)科 黃小虎全自動(dòng)生化分析儀生化分析儀特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)亮點(diǎn)自動(dòng)化機(jī)械化的儀器設(shè)備模仿 代替手工操作提高了工作效率 減少了主觀誤差靈敏 準(zhǔn)確 快速 標(biāo)準(zhǔn)化生化分析儀分類1按結(jié)構(gòu)原理分管道連續(xù)流動(dòng)式分立式常用離心式干片式急診常用2按測定速度分小型中型大型超大型（模塊式）3按自動(dòng)化程度分半自動(dòng)全自動(dòng)2004 生化分析儀主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)供排水系統(tǒng)構(gòu)成比色系統(tǒng)光源 比色杯 單色器 檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)樣品轉(zhuǎn)盤 試劑倉 取樣裝置基本原理臨床生化分析儀最常使用的是分光光度法分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。 分光光度計(jì)

2、組成光源樣品池單色器檢測器記錄裝置濾光器光吸收曲線溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。 在分光光度法中, 以吸光度為縱坐標(biāo), 以波長為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。 濃度不同的同種溶液, 在該種曲線中其最大吸收波長相同，相應(yīng)的吸光度大小則不同，同一波長下摩爾吸數(shù)相同。Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，樣品對(duì)光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比 A=kcbA-吸光度 k-吸光系數(shù) c-溶液濃度 b-液層厚度吸光系數(shù)定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度

3、大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。 討 論：1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性，如果 溶液中同時(shí)存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì) ,則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物質(zhì)吸光度的總和，即： A（a+b+c）AaAbAc應(yīng)用：多組分測定定量分析方法(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法(3) 吸光系數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法最經(jīng)典方法前提：固定儀器和固定條件 A= K*BC 過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列 分別測定 A 得CA曲線 樣品 測定A樣 查

4、得C樣標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的樣品溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax ，依據(jù)朗伯-比爾定律得: As=Kbcs Ax=Kbcx 則: cx = cs*Ax /AsX吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對(duì)法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式AKbc進(jìn)行計(jì)算的定量分析方法。在手冊(cè)中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長 處的吸光系數(shù) 或 ,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為： 或檢測方法1.終點(diǎn)法 2.固定時(shí)間法3.連續(xù)監(jiān)測法 終點(diǎn)法 終點(diǎn)分析法是基于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對(duì)光吸收強(qiáng)度的大小，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量的一類分析

5、方法。反應(yīng)混合物進(jìn)行一定時(shí)間反應(yīng)后，達(dá)到平衡終點(diǎn)，即在顯色反應(yīng)處于穩(wěn)定階段時(shí)，監(jiān)測其顏色對(duì)光的吸收強(qiáng)度，以此計(jì)算待測物濃度。終點(diǎn)時(shí)間的確認(rèn)：一、根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線 如:Trinder（偶聯(lián)終點(diǎn)比色法）反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘時(shí)其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點(diǎn)。二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定 如:溴甲酚綠法測血清白蛋白 分 類終點(diǎn)法： 一點(diǎn)終點(diǎn)法 二點(diǎn)終點(diǎn)法 免疫比濁法 雙波長法一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)，選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點(diǎn)附近連續(xù)讀兩個(gè)吸光度，求出兩點(diǎn)的平均值，并根據(jù)兩點(diǎn)的差值判斷反應(yīng)是否達(dá)到平衡。一點(diǎn)終

6、點(diǎn)法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)達(dá)到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成直線，對(duì)于反應(yīng)速度比較快的實(shí)驗(yàn)多用。 多見于單試劑項(xiàng)目，如：總蛋白，白蛋白等。2022/7/2221Am T（時(shí)間）AS+R(吸光度）一點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)曲線 計(jì)算公式： C=(Am-Ab)*KAm-終點(diǎn)讀數(shù)點(diǎn)的吸光 Ab-試劑空白吸光度 K-校正系數(shù)TP反應(yīng)曲線蛋白質(zhì)+Cu2+Cu-蛋白質(zhì)絡(luò)合物 550nm處吸收峰二點(diǎn)終點(diǎn)法第二試劑加入以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時(shí)間后反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后測第二個(gè)吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計(jì)算結(jié)果。第一點(diǎn)吸光度值由樣

7、本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時(shí)間）兩點(diǎn)終點(diǎn)樣本空白=S+R1S+R1+R2（體積校正因子）k0 計(jì)算公式 C=(An-K0*Am)*K CRE反應(yīng)曲線肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反應(yīng)生成紅色醌類物質(zhì)，在540nm處有吸收峰。Mg反應(yīng)曲線在堿性溶液中，Mg與二甲苯胺藍(lán)形成重氮鹽類的紫色復(fù)合物，Mg2+濃度可由二甲苯胺藍(lán)吸光度的下降，通過光度測定法來測定。免疫比濁法 通過物質(zhì)對(duì)光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的 方法： 散射比濁：特定蛋白分析儀

8、透射比濁：自動(dòng)生化分析儀 通常作兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析，多采用多點(diǎn)校準(zhǔn)。 應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab過量，此時(shí)Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射強(qiáng)度與抗原量成正比。免疫比濁法優(yōu)點(diǎn)： 方法簡便 結(jié)果準(zhǔn)確 可用于自動(dòng)化儀器檢測缺點(diǎn)：抗體用量大 達(dá)平衡時(shí)間長雙波長法 消除樣品中對(duì)測定有干擾的物質(zhì)的影響； 在試樣中含有兩個(gè)組分a和b時(shí)，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長2 ，使組分a在這兩個(gè)波長處的吸光度相等。 試樣溶

9、液在2和1兩個(gè)波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300-600nm呈下降趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰3.膽紅素：300-500nm有吸收峰 可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。雙波長法雙波長測定優(yōu)點(diǎn) ： 消除噪音干擾 減少雜散光影響 減少樣品本身光吸收的干擾 固定時(shí)間法 指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測光點(diǎn)，這兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，利用這兩點(diǎn)吸光度差值計(jì)算結(jié)果。 如：苦味酸法測肌酐 計(jì)算公式： C=(A2-A1)*KA1A2T(吸光度） 測定底物的消耗或產(chǎn)物生成的速度

10、的化學(xué)方法稱為連續(xù)監(jiān)測法（又稱動(dòng)態(tài)分析法、速率法或動(dòng)力學(xué)法）。在反應(yīng)速度恒定期（零級(jí)反應(yīng)期）來連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化。通過測定一段時(shí)間內(nèi)吸光度的變化速率（ A/min ）來計(jì)算待測物的濃度。 酶活性測定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用連續(xù)監(jiān)測法（速率法）酶促反應(yīng)曲線連續(xù)監(jiān)測法 即零級(jí)反應(yīng)速率法,亦稱斜率法 在較長反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時(shí)間(530秒)讀取一次吸光度值，至 少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)以上A，最后算出 反應(yīng)速率A/min。酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線2022/7/2238A1TAS+R1R2A2(吸光度）（時(shí)間）連續(xù)監(jiān)測法A/min=(A2-A1

11、 )-(空白)/(t2-t1)t2t1連續(xù)監(jiān)測法特點(diǎn) 與固定時(shí)間法相比，屬于即時(shí)觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點(diǎn)的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進(jìn)程，很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級(jí)反應(yīng)。典型酶聯(lián)法反應(yīng)曲線ALT反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線生化結(jié)果報(bào)告審核責(zé)任心不強(qiáng)，未對(duì)結(jié)果進(jìn)行認(rèn)真審核對(duì)檢測儀器或試劑方法學(xué)不夠了解工作經(jīng)驗(yàn)不足對(duì)儀器檢測的結(jié)果及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果過于相信1.結(jié)合質(zhì)控判斷結(jié)果在控在控GLO=TPALB偏高2.結(jié)合臨床資料審核結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷、其他檢查結(jié)果審核 例：某病人檢測的TP為110g/L，該標(biāo)本沒有脂血等影響檢測結(jié)果的因素

12、臨床診斷：多發(fā)性骨髓瘤 另：胰島素與低血糖、病人輸注藥物對(duì)結(jié)果的影響檢驗(yàn)項(xiàng)目間的內(nèi)在聯(lián)系各檢測參數(shù)間存在大小、比例、邏輯關(guān)系例：TC HDL-C+LDL-C、 TBI DBI CK CK-MB LDH-HBDH影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素 試劑線性范圍： 了解檢驗(yàn)項(xiàng)目試劑的線性范圍，對(duì)超過或低于范圍的項(xiàng)目，必須進(jìn)行相應(yīng)的減量稀釋或增量后重新測定。線性范圍 在實(shí)際工作中，用連續(xù)監(jiān)測法會(huì)遇到檢驗(yàn)結(jié)果為0或者負(fù)值的情況，此時(shí)不能盲目相信該結(jié)果低就出具低值報(bào)告，應(yīng)查看其反應(yīng)曲線例：某病人的尿液AMY檢測結(jié)果為0U/L 其反應(yīng)曲線如下圖：AMY反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線分析分析：由于測定物質(zhì)濃度過高處理：對(duì)測定物質(zhì)進(jìn)

13、行十倍左右的稀釋再測定，直到反應(yīng)曲線恢復(fù)正常結(jié)果才可靠AMY反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線第一次稀釋后檢測項(xiàng)目的方法學(xué) 分析：CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體，其構(gòu)成為CK-MB(心型)約占0-3%、 CK-MM(肌型)約占97-100%、 CK-BB（腦型）約占0-1% 影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素 檢測項(xiàng)目的方法學(xué)： 要了解該項(xiàng)目試劑采用的方法學(xué)： 例：某病人在測定心肌酶譜時(shí)，其CK:246U/L、CK-MB:286U/L，標(biāo)本無溶血等因素影響,其結(jié)果中CK-MBCKCK-MB采用的檢測方法為免疫抑制法 正常人體中，CK同工酶中CK-MMCK-MBCK-BB,其中CK-BB含量極少，可忽略。免疫抑制法正是

14、建立于忽略CK-BB的基礎(chǔ)上。采用抗體抑制其M亞基活性，使CK-MM失去活性，而CK-MB失去一半的活性。單測定B亞基的活性，其結(jié)果2即為CK-MB活性。由于在患輕度或中度腦損傷、腦血管意外及腦手術(shù)后 造成腦組織發(fā)生實(shí)質(zhì)性損害的病人中，CK-BB會(huì)升高，這時(shí)該方法測定的CK-MB的活性相當(dāng)于是CK-MB+2CK-BB的活性之和，造成CK-MB活性假性升高。檢驗(yàn)標(biāo)本的影響 標(biāo)本脂血會(huì)使反應(yīng)濁度增加，透光度下降，吸光度增加，從而造成檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。如TP、TG、UA顯著增高，GGT顯著下降或?yàn)? 標(biāo)本溶血會(huì)使K+、ALT、AST、LDH等檢驗(yàn)結(jié)果顯著升高抗凝劑的錯(cuò)誤使用儀器性能影響 儀器老化、故障、清洗管道堵塞、水質(zhì)不純等均會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響 光路老化：表現(xiàn)為CK-MB,ALP,ALT、AST等項(xiàng)目結(jié)果重復(fù)性較差 水質(zhì)不純、反應(yīng)杯清洗不干凈：表現(xiàn)為無機(jī)物質(zhì)結(jié)果不準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果的總體趨勢 即使質(zhì)控在控，也要注意當(dāng)日檢驗(yàn)結(jié)果的總體的分布趨勢 如K+的參考區(qū)間為3.55.5，中值為4.5，如果當(dāng)日結(jié)果大部分甚至全