RNA功能及其研究進展演示教學

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNA功能及其研究進展-RNA功能及其研究進展摘要核糖核酸(RiboNucleicAcid簡稱RNA)由至少幾十個核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。RNA普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)。RNA和蛋白質(zhì)生物合成有密切的關系。在RNA病毒和噬菌體內(nèi)，RNA是遺傳信息的載體。RNA一般是單鏈線形分子;也有雙鏈的如呼腸孤病毒RNA；環(huán)狀單鏈的如類病毒RNA；1983年還發(fā)現(xiàn)了有支鏈的RNA分子。RNA能夠充當“信使”,傳遞DNA(脫氧核糖核酸)上的遺傳信息

2、,將其用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)合成。研究顯示,向生物體內(nèi)注入微小RNA片段,會干擾生物體本身的RNA“信使”功能,導致相應蛋白質(zhì)無法合成,從而“關閉”特定基因。科學家認為,采用RNA干擾技術直接從源頭上讓致病基因“沉默”,也許可以更有效地治療某些疾病。前言RNA指ribonucleicacid核糖核酸，核糖核苷酸聚合而成的沒有分支的長鏈。分子量比DNA小，但在大多數(shù)細胞中比DNA豐富。RNA主要有3類，即信使RNA（mRNA），核糖體RNA（rRNA）和轉運RNA（tRNA）。這3類RNA分子都是單鏈，但具有不同的分子量、結構和功能。rRNA是核糖體的組成成分，由細胞核中的核仁合成，而mRNA、tRN

3、A在蛋白質(zhì)合成的不同階段分別執(zhí)行著不同功能。mRNA是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁。tRNA的功能是攜帶符合要求的氨基酸，以連接成肽鏈，再經(jīng)過加工形成蛋白質(zhì)。在RNA病毒中，RNA是遺傳物質(zhì)，植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些比病毒還小得多的浸染性致病因子，叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質(zhì)的閉環(huán)單鏈RNA分子，此外，真核細胞中還有兩類RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前體；snRNA參與hnRNA的剪接（一種加工過程）。RNA

4、干擾（RNAinterference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡單的說是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發(fā)的HYPERLINK/view/201603.htmt_blank基因沉默現(xiàn)象。當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默。與其它基因沉默現(xiàn)象不同的是，在植物和HYPERLINK/view/107703.htmt_blank線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細胞之間傳播，此現(xiàn)象被稱作系統(tǒng)性RNA干擾(systemicRNAi)

5、。RNAi與轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)在分子層次上被證實是同一種現(xiàn)象。RNA干擾是基因轉錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進化的高度保守的現(xiàn)象之一。RNAi是通過siRNA介導的特異性高效抑制基因表達途徑，由siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反應特征，反應中需要多種蛋白因子以及ATP參與。關鍵詞核糖核酸mRNAtRNArRNARNA干擾RNA種類及功能在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)主要有三種不同的RNA分子在基因的表達過程中起重要的作用。它們是信使RNA（messengerRN

6、A，mRNA）、轉運RNA（tranferRNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）。RNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。RNA的一級結構主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。天然RNA的二級結構，一般并不像DNA那樣都是雙螺旋結構，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結構的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需要46對堿基對

7、才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同。細胞內(nèi)有三類主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。在大多數(shù)細胞中RNA的含量比DNA多58倍。mRNA生物的遺傳信息主要貯存于DNA的堿基序列中，但DNA并不直接決定蛋白質(zhì)的合成。而在真核細胞中，DNA主要貯存于細胞核中的染色體上，而蛋白質(zhì)的合成場所存在于細胞質(zhì)中的核糖體上，因此需要有一種中介物質(zhì)，才能把DNA上控制蛋白質(zhì)合成的遺傳信息傳遞給核糖體?，F(xiàn)已證明，這種中介物質(zhì)是一種特殊的RNA。這種RNA起著傳遞遺傳信息的作用，因而稱為信使RNA(messengerRNA，mRNA)。mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地

8、轉錄下來，然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，完成基因表達過程中的遺傳信息傳遞過程。在真核生物中，轉錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列，大約只有25%序列經(jīng)加工成為mRNA，最后翻譯為蛋白質(zhì)。因為這種未經(jīng)加工的前體mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差別很大，所以通常稱為不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）。tRNA如果說mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍圖，則核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。但是，合成蛋白質(zhì)的原材料20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA轉運RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬

9、運到核糖體上，tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準確地將它攜帶的氨基酸連結起來形成多肽鏈。每種氨基酸可與1-4種tRNA相結合，現(xiàn)在已知的tRNA的種類在40種以上。tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均約為27000（25000-30000），由70到90個核苷酸組成。而且具有稀有堿基的特點，稀有堿基除假尿嘧啶核苷與次黃嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。這類稀有堿基一般是在轉錄后，經(jīng)過特殊的修飾而成的。1969年以來，研究了來自各種不同生物，:如酵母、大腸桿菌、小麥、鼠等十幾種tRNA的結構，證明它們的堿基序列都能折疊成三葉草形二級結構，而且都具有如下的共性：5末端具有G（大部分）

10、或C。3末端都以ACC的順序終結。有一個富有鳥嘌呤的環(huán)。有一個反密碼子環(huán)，在這一環(huán)的頂端有三個暴露的堿基，稱為反密碼子（anticodon）.反密碼子可以與mRNA鏈上互補的密碼子配對。有一個胸腺嘧啶環(huán)。rRNA核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)是組成核糖體的主要成分。核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。在大腸桿菌中，rRNA量占細胞總RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA僅占3-5%。rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結合在一起，形成核糖體（ribosome），如果把rRNA從核糖體上除掉，核糖體的結構就會發(fā)生塌陷。原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。S為

11、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient），當用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時，此速度與粒子的大小直徑成比例。5S含有120個核苷酸，16S含有1540個核苷酸，而23S含有2900個核苷酸。而真核生物有4種rRNA，它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。rRNA是單鏈，它包含不等量的A與U、G與C，但是有廣泛的雙鏈區(qū)域。在雙鏈區(qū)，堿基因氫鍵相連，表現(xiàn)為發(fā)夾式螺旋。rRNA在蛋白質(zhì)合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3端有一段核苷酸序列與mRNA的前導序列是互補的，這可能有助于mRNA與核糖體的結合

12、。snRNA除了上述三種主要的RNA外，細胞內(nèi)還有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真核生物轉錄后加工過程中RNA剪接體（spilceosome）的主要成分?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有五種snRNA，其長度在哺乳動物中約為100-215個核苷酸。snRNA一直存在于細胞核中，與40種左右的核內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成RNA剪接體，在RNA轉錄后加工中起重要作用。另外，還有端體酶RNA(telomeraseRNA)，它與染色體末端的復制有關；以及反義RNA(antisenseRNA)，它參與基因表達的調(diào)控。有的RNA分子還具有生物催化作用。上述各種RNA分子均為轉錄的產(chǎn)物，mRNA最后翻譯為蛋

13、白質(zhì)，而rRNA、tRNA及snRNA等并不攜帶翻譯為蛋白質(zhì)的信息，其終產(chǎn)物就是RNA。RNA研究進展RNA干擾（RNAi）RNAi的定義目前對HYPERLINK/view/35842.htmt_blankRNAi(RNAinterference)的定義有很多種，不同的資料對其定義的側重點也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學現(xiàn)象，可以有以下定義：RNAi是由dsRNA介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。RNAi是有dsRNA參與指導的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標的轉基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機制，是一種當外源基因

14、導入或病毒入侵后，細胞中與轉基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。如果將其作為一門生物技術，則定義為：RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21nt23nt的小片段，使相應的基因沉默。RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應的功能表型

15、缺失,屬于轉錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。簡單地可以說，RNAi就是指由RNA介導的基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾研究最近由于RNA干擾（RNAinterference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)使反義領域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是序列特異性地使轉錄后的基因沉默的有力機制。由于最近兩年在RNAi領域取得的進步，已經(jīng)有許多這方面的綜述發(fā)表。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發(fā)動的，該分子可以被Dicerenzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA。RNAseIII蛋白被認為是作為一個二聚體發(fā)揮作用，它對雙鏈RN

16、A的兩個鏈都進行切割，酶切的產(chǎn)物3末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（smallinterferingRNAs，siRNAs）摻入RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），引導核酸酶降解靶RNA。這種保守的生化機制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動物細胞中的應用受到阻礙，因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素應答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破。這個發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RNAi技術對哺乳動物細胞的研究，因為與傳統(tǒng)的反義技術比，RNAi的性能明顯較高。有趣

17、的是，除了短雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA），比如莖環(huán)結構在細胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，從而產(chǎn)生RNA干擾。這使得構建表達干擾RNA的載體，從而使哺乳動物細胞內(nèi)基因表達長期沉默成為可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉錄，在正常情況下，該啟動子是控制小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1RNA（11）轉錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉錄出來（6、12、13）。載體介導的siRNA表達使對功能缺失（loss-of-function）表型進行長期分析

18、成為可能。在穩(wěn)定轉染的細胞內(nèi)，兩個月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象。另外一種延長siRNA抑制基因表達時間的方法是對化學合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對siRNA的穩(wěn)定性進行進一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷。一個5端為兩個2-O-甲基RNA、3端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時間延長。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導致siRNA活性下降。RNA干擾在哺乳動物體內(nèi)的第一個研究是

19、利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈。在大多數(shù)器官中，報道基因（編碼于共轉染質(zhì)?；蛘咿D基因小鼠上）的表達可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關的內(nèi)源靶標進行了RNA干擾實驗。注射siRNA之后，小鼠肝細胞中的FasmRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對照小鼠在3天之內(nèi)死亡。上述研究中采用的高壓導入技術是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標準的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反轉錄病毒載體被用于導入siRN

20、A，以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因。負調(diào)控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性，因為只有癌基因K-ras被沉默，而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當在紋狀區(qū)注射表達siRNA的腺病毒之后，轉基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制。葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用于這個實驗，為設計組織特異性或者可誘導的siRNA載體打開了大門。

21、總的來說，siRNA的第一個體內(nèi)實驗已經(jīng)進行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統(tǒng)的反義技術相似，研究者將從十多年來反義技術研究的教訓中獲益，比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的，以及對免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進行詳細分析。miRNA技術miRNAs定義miRNAmicroRNAs（miRNAs）是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRN

22、A堿基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進化中相當保守，在植物、動物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達，miRNAs組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNAs在細胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。miRNA原理miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II(polII)轉錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RANGTP和export

23、in5將pre-miRNA輸送到細胞質(zhì)中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入沉默復合體(RISC)復合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過堿基配對調(diào)控基因表達。與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達（哺乳動物中比較普遍）。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機制的miRNA結合位點通常在mRNA的3端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點完全互補（或者幾乎完全互補），那么這些miRNA的結合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。通過這種機制作用的miRNAs的結合位點通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。miRNAs研究目前只有一小部分miRNAs生物學功能得到闡明。這些miRNA