胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)報(bào)告

1、南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)姓名：學(xué)院：專(zhuān)業(yè)：班級(jí)：學(xué)號(hào)：胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一母液的配制與保存一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)母夜的配制方法和母液的保存方式。2.熟悉掌握制備母液的操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基中提供植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，才能滿足植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育的需求。主要包括水分、有機(jī)物質(zhì)、鹽類(lèi)，而配制母液時(shí)將其分為大量、微量、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、有機(jī)和肌醇分別配制。配谿培養(yǎng)基時(shí)，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，通常采用母液法進(jìn)行配谿，即按培養(yǎng)基配方中各試劑的用量，擴(kuò)大若干倍后再準(zhǔn)確稱量分別先配制成一系列的母液谿于冰箱中保存，使用時(shí)按比例吸取母液進(jìn)行稀釋配谿即可。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備.試劑NH4N

2、O3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2 2H2O ,MgSO4 7H2O,FeSO4 7H2O Na2-EDTA, MnSO4 4H2O,ZnSO4 7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4 2H2OCuSO4 5H2O,CoCl2 6H2O,肌醇，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸毗哆醇，煙酸，蒸儲(chǔ)水。.儀器設(shè)備電子天平，燒杯（50ml、100ml、500ml ）量筒（1000ml、100ml、25ml ）,容量瓶（1000ml、 500ml、100ml）,移液管（10ml, 5ml , 1ml）試劑瓶，玻璃棒數(shù)支，藥芍，稱量紙等。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、計(jì)算：計(jì)算各化學(xué)成分所需要的量。大量、微

3、量和鹽類(lèi)按擴(kuò)大50倍，定容500ml的配制計(jì)算。有機(jī)和肌醇按擴(kuò)大100倍，定容200ml的配制計(jì)算。計(jì)算后制成配方表。 2、制定標(biāo)簽：裁取 7張適當(dāng)大小的牛皮紙，用鉛筆寫(xiě)上 MS,種類(lèi)，并標(biāo)明此類(lèi)母 液所含物質(zhì)，質(zhì)量，定容體積，擴(kuò)大倍數(shù)吸取量，制備人，制備日期。3、大量元素母液的配制：先用量筒量取 300ml蒸儲(chǔ)水放入500ml燒杯中，按照配方表中用量依次分別稱?。篘H4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 ,待第一種化合物完全溶解后再加入第二種化合物，溶解過(guò)程用玻璃棒攪拌，當(dāng)最后一種化合物完全溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至 500ml容量瓶中，并用蒸儲(chǔ)水將燒杯和玻璃棒洗滌3次，每次約50ml,而后用蒸

4、儲(chǔ)水定容至500ml ,然后轉(zhuǎn)移至細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，并谿于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?、微量元素母液的配制按照配方表中用量用電子天平依次稱 取 MnSO4 4H2O, ZnSO4 7H2O , H3BO3, KI, Na2MoO4 2H2O 。 CuSO4 5H2O 和CoCl2 6H2O先稀釋后用移液管吸取，按制備母液I的方法逐個(gè)溶 解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，/ 5洗滌燒杯，然后定容至500ml ,轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中， 貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)， 配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、鐵鹽母液的制備 把FeSO4 7H2O和Na2-EDTA分別谿于適量蒸儲(chǔ)水中，加熱攪拌使 之完全溶解，

5、保持加熱，把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并攪拌，接近沸騰時(shí)停止加熱，冷卻后調(diào)PH到5.5 ,將溶液轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，洗滌后用蒸儲(chǔ)水定容至 500ml ,轉(zhuǎn)入 細(xì)口試 劑瓶中，用力振蕩12min ,貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、有機(jī)化合物母液的制備按配方表中用量依次稱?。蝴}酸硫胺素，鹽酸口比哆酉I,煙酸，甘氨酸，用蒸儲(chǔ)水溶解后，定容 200ml轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍 數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、植物生長(zhǎng)物質(zhì)母液制備 NAA母液:準(zhǔn)確稱取10mg,用少量1mol/L NaOH溶解后加蒸儲(chǔ)水

6、 定容至100ml,即配制成0.1mg/ml的NAA母液，轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液 名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存?zhèn)溆谩? - BA母液配制方法相似，濃度為2mg/ml五、試驗(yàn)結(jié)果分析及注意事項(xiàng)1、KH2PO4是吸熱溶解，可以把燒杯浸在溫水中溶解。2、制作標(biāo)簽時(shí)只能能用鉛筆寫(xiě)。實(shí)驗(yàn)二、培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)母液法配制培養(yǎng)基。2、學(xué)習(xí)用牛皮紙包三角瓶口的防污染方法。3、學(xué)習(xí)滅菌鍋的使用。二、實(shí)驗(yàn)原理為防止組織培養(yǎng)各物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)所以把微量和鐵鹽混在一起，為了避免物質(zhì)的反應(yīng)，所以要迅速倒入沸騰的蒸儲(chǔ)水中，瓊脂應(yīng)慢慢倒入，并邊攪拌邊倒入。組織培養(yǎng)所用的培

7、養(yǎng)基含有植物生長(zhǎng)所必需的各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是微生物繁殖的極好場(chǎng)所，因此必須對(duì)培養(yǎng)基滅菌處理，以確保無(wú)菌操作的順利進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備.試劑：瓊脂，蔗糖，蒸儲(chǔ)水，1mol/L NaOH,各類(lèi)母液2.儀器設(shè)備：電子天平，燒杯，量 筒，移液管，玻璃棒，藥芍，稱量紙，PH試紙，錐形瓶，牛皮紙，棉塞等。四、實(shí)驗(yàn)步驟.準(zhǔn)備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定谿。.大量的量取 取50ml量筒一個(gè)，將大量、有機(jī)、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依 次稱取并倒入500ml燒杯中。.微量鐵鹽的量取 取50ml量筒一個(gè)，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。

8、.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個(gè)，加入 1.5L蒸儲(chǔ)水，谿于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒 入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。再稱量瓊脂16克，白砂糖60克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至2L。5、調(diào)PH用1mol/L NaOH和1mol/LHCl調(diào)PH至6.0。6、分裝把培養(yǎng)基分裝到三角瓶 中，每瓶約50ml ,用棉塞塞好再用牛皮紙，細(xì)繩包扎好，待滅菌。7、滅菌將所有的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調(diào)為 121度滅菌20min。滅 完后擺放在水平的實(shí)驗(yàn)桌上勿動(dòng)。五、試驗(yàn)結(jié)果分析及注意事項(xiàng)1、配制培養(yǎng)基前先大致估計(jì)一下藥品數(shù)量，不夠時(shí)提前配制。2、三角瓶滅菌時(shí)

9、注意要放干凈冷空氣。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。4、滅完菌的三角瓶勿動(dòng)，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。實(shí)驗(yàn)三、胡蘿卜外植體的表面消毒及接種一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義培養(yǎng)材料的滅菌與接種是組織培養(yǎng)過(guò)程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，領(lǐng)會(huì)無(wú)菌培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料消毒，接種的要求，初步掌握培養(yǎng)材料滅菌，接種的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)步驟(1)準(zhǔn)備好培養(yǎng)基、無(wú)菌水、無(wú)菌濾紙、解剖刀、鐐子、打火機(jī)等及接種工具。(2)將培養(yǎng)基、無(wú)菌水、接種工具谿于接種臺(tái)上，打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈開(kāi)關(guān)，同時(shí)打開(kāi)接種室內(nèi)的紫外燈，用紫外燈照射至少25min ,然后關(guān)室內(nèi)的紫外燈，開(kāi)送風(fēng)開(kāi)關(guān)，關(guān)閉臺(tái)內(nèi)的紫外燈，通風(fēng)10min后，再開(kāi)日光燈進(jìn)行無(wú)菌操作

10、。(3)接種前用肥皂洗手，特別是將手指洗凈，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。(4)將外植體進(jìn)行表面滅菌。(6)用75%酒精擦洗接種臺(tái)表面。(7)接種用的鐐子使用前插入 75%的乙醇溶液中，使用鐐子時(shí)在酒精燈上灼燒，冷卻后待用。也可以插入培養(yǎng)基邊緣促使其冷卻。(8)在酒精燈火焰旁揭去封口膜，將瓶口傾斜接近水平方向，用火焰灼燒瓶口，灼燒時(shí)應(yīng) 不斷轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口，左手持瓶，使其靠近火焰，右手將燒過(guò)的鐐子觸動(dòng)培養(yǎng)基部分，使其冷卻， 夾取切好的胡蘿卜小塊，將其放在培養(yǎng)基上，用鐐子輕輕按一下，使其部分浸入培養(yǎng)基。(9)轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口灼燒，蓋上封口膜，標(biāo)上接種日期、材料名稱、姓名等。(10)將接種材料移到培養(yǎng)室

11、培養(yǎng)。三、注意事項(xiàng)(1)工作臺(tái)接種時(shí)，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動(dòng)作。操作過(guò)程中要不時(shí)用75%的酒精擦拭雙手。(2)接種前的污染現(xiàn)象：若菌類(lèi)只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時(shí)，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴(yán)或放谿培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌群密度過(guò)大所致。若菌類(lèi)存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。培養(yǎng)瓶不潔凈、滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的 原因。（3）接種后的污染：菌落分布不勻 ，此種情況主要是接種過(guò)程中發(fā)生的污染所致。可能是接 種室不潔凈、菌類(lèi)池子過(guò)多、鐐子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺(tái)。出現(xiàn)故障等原因引起。避免方法：保持無(wú)菌接種室潔凈；在接種前用紫外燈滅菌時(shí)間不低于20-30 min ;用75%酒精噴霧殺菌降塵，超凈臺(tái)開(kāi)啟 15-20 min后方可使用；鐐子等接種工具嚴(yán)格徹底滅菌；操作 過(guò)程中經(jīng)常用 75%酒精等消毒劑擦洗手部等措施接種后外植體周?chē)l(fā)生菌類(lèi)污染可能因外 植體表面滅菌不徹底所致。如果培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說(shuō)明消毒劑浸泡的時(shí)間短；若接種材料雖然沒(méi)有污染， 但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織被破壞死亡；接種材料若沒(méi)有出現(xiàn)污染，生 長(zhǎng)正常，即可以認(rèn)為消毒時(shí)間適宜。四、胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果總接種材接種時(shí)間形成愈傷污染的材愈傷組織污染率備注料數(shù)（大）組織的材料數(shù)