分子生物學(xué)之DNA復(fù)制課件

1、 第3章 DNA復(fù)制 (DNA Replication) 3.1. 基本概念3.2. 復(fù)制起點與方向 3.3. Semi-Conservation Replication 3.4. 復(fù)制的方式 3.5. 線狀 DNA的復(fù)制3.7. DNA復(fù)制的基因與酶類體系 3.8. DNA復(fù)制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控 3.9. Methylation of DNA 3.6. The termination of DNA 3.1. 基 本 概 念 ( Basic Concept ) 遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學(xué)的核心Watson & Crick: 一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種 功能，即自我復(fù)制和對細胞的高 度特異性

2、的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制 基因的突變 控制性狀的表達DNA復(fù)制 親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以 每單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補 配對的游離的dNTP, 合成出兩條與親代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的過程。 Replicon; 基因組中能獨立進行復(fù)制的單位。 Replisome; A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator The multi protein (30) structure that assembles at re

3、plicating fork to undertake synthesis of DNA DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs?3.2. 復(fù)制起點與方向（replication origin & direction ） rich AT & palindrom Enzymes binding site 復(fù)制起點的特征E.coli 復(fù)制起點oriC245bp, 序列保守成串排

4、列的三個13bp序列四個9bp序列DnaA蛋白結(jié)合位點真核生物復(fù)制起點的研究是以酵母為基礎(chǔ)的ARS (automatic Replication Sequence) 自主復(fù)制序列ARS1 (A, B1,B2,B3) A區(qū)具有高度保守性 B區(qū)變化較大AT rich 復(fù)制的多模式 單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向1963 Cairns 37 , 5 ci / mM H3-T , 6min 37 , 52 ci / mM H3-T , 6min 42 , T, one circle DNA雙向復(fù)制的證據(jù) 模式？E. coli mut.ts 復(fù)制發(fā)動溫度敏感突變型42不能發(fā)動DNA復(fù)制、但可

5、完成DNA延伸模式 ？單 起 點、雙 方 向兩個復(fù)制叉 子鏈DNA延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5 to 3 direction ppp OH C+ ppi 如果DNA的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要， DNA的5 端必須帶有PPP游離dNTP具有pppppp OH 3

6、 A T C G 在0.2M NaCl 的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使dNTP難以聚合到DNA的5端，而且雙鏈DNA的5端堿基配對困難。堿基發(fā)生錯配后的校正 費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗） A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 3.3. DNA的半保留復(fù)制 （Semi-Conservation Replication） 半保留復(fù)制的實驗驗證3535OK !How ?5353one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kb53535353（semi-

7、discontinuous replication ! ） ？a)Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous replication） 證據(jù) Okazaki片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復(fù)制提供了有力的證據(jù)。 Prok. 1-2kb, Euk. 0.1-0.2kb 在復(fù)制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)合成的復(fù)制機制。leading strand lagging strand leading strand（前導(dǎo)鏈） ：連續(xù)復(fù)制lagging strand（后隨鏈）：按Okazaki 片段不連續(xù)復(fù)制3.4. DNA

8、復(fù)制的方式 (DNA replication model) starting point RNA primer transcription activation leading strand fork lagging strand 復(fù)制叉式（replication fork） 環(huán)狀DNA復(fù)制 （ form ，50，000bp/min)多復(fù)制子 真核生物（1000-3000bp/min) 大多數(shù)生物染色體采取雙向?qū)ΨQ復(fù)制。枯草桿菌采取不對稱復(fù)制。 DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復(fù)制起始. DNA聚合酶行使聚合作用需要：引物提供3-OH以四種dNTP作為底物模板指導(dǎo)延伸方向53 RNA引物的合成

9、（ATP，GTP，CTP，UTP） RNA聚合酶和引物合成酶(primase) 引物的長度：幾個10個核苷酸 DNA聚合酶I：RNA引物的消除和缺口的填補 primer DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活 (transcriptional activation） RNA polymerase Rif S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprimase Rif R for lagging Strand primosome Synthesis of progeny strand in lagging DNA pppRNA as primerDNA p

10、olymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase RNApol (RNA polymerase) Rif S dnaG (primase) Rif R 完成對后隨鏈引物的合成 完成10 Nt RNA引物合成后. DNApol III進行DNA鏈的延伸 DNApol I 對RNA引物切除并聚合填補 連接酶 (ligase）將連接 Okazaki 片段.完成對先導(dǎo)鏈引物的合成 實現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較先導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷 Conclusion 共價延伸方式（covalence elongation）或 滾環(huán)方

11、式 （rolling circle）D.S. DNA Nick leading StrandElongation rolling Lagging StrandX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）DNA鏈，成為（+/-）雙鏈DNA分子，即復(fù)制型RFI.（+）鏈DNA復(fù)制起點被特異性A蛋白切斷，3和5端游離出來。（-）DNA為模板， 以 （+）鏈DNA 3-OH為引物，DNA聚合酶III合成新鏈（+）。 原來的（+）鏈DNA 被取代。（+）鏈DNA被滾出一定 長度后，產(chǎn)生環(huán)狀（+）鏈DNA。（+/-）DNA鏈，繼續(xù)參與復(fù)制。 置換式 或 D-Loop （Displacement

12、 form） D.S. DNA In mitochondrial DNA also in chloroplast DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-LoopTop I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)DnaB proteinDnaC protein Primase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase for primosome復(fù)制體進 化 中 形 成 了 靈 活 的 多 酶

13、 復(fù) 合 體 replisomeprimosome （引發(fā)體） PriA (dual role) displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at prepriming stage DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase(引物酶) 進 化 中 形 成 了 靈 活 的 多 酶

14、復(fù) 合 體 replisome 位于復(fù)制叉處的多酶復(fù)合體完成 lagging Strand DNA延伸時 必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段 In lagging Strand 多酶系統(tǒng) 必須完成多次反復(fù)的啟動與擴展 E.coli 啟動20004000次的岡崎片段復(fù)制3.5. 線狀 DNA的復(fù)制 及避免5末端短縮的模式 （5-end shortend ） 3-OH ? 3-OHLagging strand of 環(huán)狀 DNA replication Lagging strand of 線狀 DNA replication But 3-OH ? Watson J. D T7 phage Di

15、rect repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offspring DNA after replication ?concatermer 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHb) 真核生物染色體 DNA末端補齊模式 端粒的發(fā)現(xiàn) 1938 Muller X-ray Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為Telomer 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。1970s 分子生物

16、學(xué)發(fā)展 端粒研究獲得突破 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) 1985. 四膜蟲 端粒酶（telomerase ）將T2G4 末端重復(fù)延伸 = RNA ( CAACCCCAA ) 鏈 + 端粒結(jié)合蛋白 model Telomerase 是反轉(zhuǎn)錄酶 RNA 與 3 end of DNA 互補, 作為合成 cDNA的模板T2G4的延伸以端粒 3-end 作引物 G鏈 T2G4-TTGGGGTT

17、GGGG C鏈-A2C4- telomerase 3 AACCCCAAC- 5 TTGG鏈 T2G4-TTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- TTG telomerase 3 AACCCCAAC- 5 GGGTTGG鏈 T2G4-TTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- TTGGGGTTGGGGTTG - telomerase 3 AACCCCAAC- 5 telomerase 3 AACCCCAAC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 AACCCCAAC- 5 G G hoogsteen bond 四股螺旋 G鏈 T2

18、G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- G鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polor多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達信息DNA（ informational DNA）, 細胞將逐漸衰老和死亡。 細胞分裂端粒閾值細胞停止分裂或死亡When telomerase activity is repressed人體發(fā)育完成

19、，端粒酶被抑制， 細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈反比細胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活性 Harley (1989)端粒的重復(fù)片段為探針檢測 胎兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株老年細胞株年齡小 大端粒長度 長 短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短PCD機制、癌細胞的無限繁殖 (癌細胞中的端粒酶被激活) 3.6 The termination of DNA replication E.coli (單起點雙方向)兩復(fù)制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復(fù)制叉簡單相遇） terE, D, A terF, B, C(22bp保守區(qū))FBTerminus Utilization Substance（TUS 36kd）C

20、ADETer-TUS復(fù)合體 terE, D, A 僅對逆時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng) terF, B, C 僅對順時針方向的復(fù)制叉具有終止效應(yīng) FBCADETer-TUS復(fù)合體 (Rep. fork trap)終止DnaB(螺旋酶)防止DNA過度復(fù)制避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝環(huán)狀DNA分子復(fù)制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體。需要拓撲異構(gòu)酶使DNA兩條鏈斷開和再連接。 3.7. DNA的復(fù)制基因 與酶類體系 原核生物的酶類 與起始有關(guān)的蛋白因子 Dna B 解開雙鏈 300kd hexamer RNApol RNA primer for leading strand Dna C 與

21、 DnaB相互作用 25kdDna G RNA primer for lagging Strand 60kd SSB 結(jié)合單鏈DNA 74kdElongation genes與酶 dnaE DNA polymerase III() 140kddnaZ DNA polymerase III() 52kdpolA DNA polymerase I 109kdpolB DNA polymerase II 90-120kd解螺旋酶和連接酶 rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNAlig Ligase缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口

22、連接dAMP復(fù)制叉兩側(cè)DNA雙螺旋的解旋E.coli C / genome = 4.2 106 bp, 40分鐘 / 每次復(fù)制歷時, 10 bp / 每圈螺旋 84000 bp 解旋 / 分 ( 8400 rpm ! 高速離心機 )DNA topoisomerase I DNA的單鏈瞬間斷裂 緩解高速旋轉(zhuǎn)DNA topoisomerase II DNA的雙鏈瞬間斷裂 緩解高速解旋時，DNA雙鏈的相互纏繞能量？拓撲異構(gòu)酶（Topoisomerase） (1)DNA拓撲異構(gòu)酶 I100kd topA編碼不需能量在DNA的一條鏈上 產(chǎn)生一個切口。superhelix D.S.helix(2)DNA拓

23、撲異構(gòu)酶 IICut D.S. DNAATPLigategyr TopII (gyrase) 400kdgyr 四聚體 ()需要能量使DNA的兩條鏈同時 發(fā)生斷裂和連接D.S.helix superhelix b) DNA聚合酶 （DNA polymerase） polA polB dnaE dnaZ 104kd 120kd 250kd monomer klenow fragmentProkaryote I II III 5 3 elongation (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + ppi 10 dNt/sec 1/10 of pol I 500dNt/sec (68,

24、36) Kornberg E 多亞基酶 多亞基酶 3 5 editing mismatch 10-8 10-3 yes 5 3 exonuclease small fragment repair No No I II III mutation lethal lethal 功能 切除引物，修復(fù) 修復(fù) 復(fù)制b; primer site c; primer terminator a; template sited; dNTP site e; 5 3 repair site 36kde胰酶68kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNA polymerase I大片段具有聚合酶

25、和35的外切核酸酶活性小片段具有5 3的外切核酸酶活性多亞基酶功能：不是復(fù)制酶，是修復(fù)酶DNA polymerase IIDNA polymerase III DNA pol III (holo Enzyme) + 核心酶 具有5 3聚合酶的活性 具有35的外切核酸酶活性功能如同夾子,夾住模板DNA分子是一種依賴DNA的ATP酶c) 真核生物DNA復(fù)制的特點及聚合酶 multiple replicon Prok. 105 bp/min Euk. 1000-3000 bp/min 5-300kb/復(fù)制子 DNApol + primase (50-60kd) 6-9 Nt RNA as prime

26、r 例；果蠅 5000 replicons受精后genome replication/3min Replicons 擴增到50,000Euk.染色體在全部復(fù)制完成之前起點不再從新開始復(fù)制。而Prok. 起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物在快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。 DNA polymerase polymerize 5 3 均有 Nuclei Nuclei Nuclei Nuclei mt editing 3 5 + + + 功能 RNA引物 DNA合成 修復(fù) 修復(fù) 修復(fù) 3.8. DNA 復(fù) 制 速 率 及 拷 貝 數(shù) 的 調(diào) 控 ( ? ! ) a) 影響因素 多種專一性的蛋白質(zhì)因子

27、濃度除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA）營養(yǎng)條件（aa starved的抑制)（原核生物）細胞復(fù)制周期速率的影響（真核生物）b) 嚴格的自我調(diào)控機制 e.g. plasmid （parasite） independent replication 嚴謹型stringent type (1-2copies) 松弛型relaxed type (10-100copies) Rop蛋白 反義RNA1 RNA-2 positive control 正調(diào)控 0-555 0 RNA-2 RNaseHOH RNA-2復(fù)制的調(diào)控e.g. ColEI plasmid負調(diào)控DNA復(fù)制方向RNA-1110 bp RNase H 不能識別D.S. RNA-1/RNA-2, 不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 bp D.S. RNARNA-1 0 W