生物實(shí)驗(yàn)知識(shí)bac文庫構(gòu)建

1、()BAC 文庫構(gòu)建技巧(2011-07-21 09:39:20)組 DNA 文庫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)技巧組 DNA 文庫有十分廣泛的用途，如用于分析、分離特定的片段，用以表達(dá)調(diào)控、人類及動(dòng)植物組工程的研究。通常情況下組文庫構(gòu)建的基本流程可以歸為 4 大步驟：分離組 DNA、對(duì)組 DNA 作相關(guān)的處理、將組 DN段連接入載體、將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。一、分離組 DNA（gDNA），優(yōu)質(zhì)的組 DNA 對(duì)于組文庫構(gòu)建是的。研究者需要查閱文獻(xiàn)，通過經(jīng)驗(yàn)來選擇合適的組 DNA 分離方法，在分離過程中保證 DNA 不被過度剪切或降解，同時(shí)也要盡量保證 DNA的純度。二、處理組 DNA根據(jù)研究目的，研究者需要選擇合適

2、的載體。不同的載體對(duì)組DNA 的長度有不同的要求，研究者必須選擇合適長度的組 DNA 來構(gòu)建組文庫。比如，對(duì)于黏粒載體（比如tre 的 pCC1FOSTM、pFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合適的片段長度大約為 40kb；對(duì)于 BAC 載體（比如centre 的 pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均來說，合適的片段長度為 120kb-300kb。構(gòu)建黏粒組 DNA 文庫，研究者需要將組 DNA 用注射器來隨機(jī)剪切 DNA；接著用末端修復(fù)酶修復(fù) DNA，可以提高 DNA 連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到 40kb 左右的DNA片段，隨后

3、使用centre GELase 膠回收試劑盒回收 DNA。構(gòu)建 BAC組 DNA 文庫，研究者需要將組 DNA 用限制性內(nèi)切酶（常用 EcoR I、BamH I 或者 Hind III）來消化組 DNA，然后通過脈沖場電泳找到合適長度的 DN段（比如 100kb-150kb），隨后透析回收 DNA。需要注意：（1）電泳時(shí)，要選用合適的 DNA Ladder，以保證電泳后可以準(zhǔn)確定位所需分子量的 DNA。用centre 試劑盒構(gòu)建黏粒文庫時(shí)，就可以直接采用文庫試劑盒內(nèi)的 Control Insert DNA 來做 marker，既方便又準(zhǔn)確。（2）電泳以后，應(yīng)該避免用紫外光照射目標(biāo) DNA，紫外

4、光照射 DNA會(huì)顯著降低克隆效率。解決方法：把 marker 所在的部分凝膠切下，在紫外燈下做好記號(hào)，然后以此為參考定位所需的片段。（3）回收 DNA 的時(shí)候，應(yīng)該要避免過度離心，以防止 DNA 被剪切，降低文庫質(zhì)量。三、載體的選擇目前，常用的組文庫載體有黏粒載體、P1 噬菌體載體、PAC 載體（P1 人工）、BAC 載體（細(xì)菌人工）和 YAC 載體（酵母人工）。選用何種載體可以參考如下幾個(gè)：1目標(biāo)區(qū)域的大小如果組的目標(biāo)區(qū)域很?。ㄐ∮?50kb），那么可以選擇黏粒載體甚至是 噬菌體載體。利用現(xiàn)有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，研究者可以方便的構(gòu)建黏粒載體文庫。如果組

5、的目標(biāo)區(qū)域比較大，那么 P1、PAC 或者 BAC 就比較合適了。P1 操作比較，PAC 相對(duì)簡便。BAC 載體也是很好的選擇，研究者可以利用現(xiàn)有的成熟產(chǎn)品來構(gòu)建 BAC 文庫，比如CENTRE 公司的一系列 BAC 載體及配套試劑盒。如果目標(biāo)區(qū)域非常大（大于 250kb），那么 YAC 載體就是首選了。不過，應(yīng)用 YAC 載體來構(gòu)建組文庫，操作非常繁瑣，一般由專門的公司來完成。表 1 各種載體的比較載體容量（kb）宿主導(dǎo)入細(xì)胞方式黏粒30-45大腸桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)P170-100大腸桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)PAC130-150大腸桿菌電轉(zhuǎn)BAC120-300大腸桿菌電轉(zhuǎn)YAC250-400酵母轉(zhuǎn)化2篩選文庫的難易程

6、度黏粒載體一般使用傳統(tǒng)的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對(duì)于構(gòu)建區(qū)域圖譜及疊連群來說既費(fèi)力又浪費(fèi)。大容量載體文庫，如 P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統(tǒng)的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用 PCR 進(jìn)行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構(gòu)建文庫，可以減少步查的步驟。3.載體拷貝數(shù)的考慮：當(dāng)把大片段 DN段克隆到高拷貝的載體時(shí)，克隆 DNA 會(huì)發(fā)生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩(wěn)定性；而單拷貝載體的低產(chǎn)量 DNA 是高通量分析的瓶頸。這個(gè)常常困擾著研究者。而CENTREs CopyControlTM 克隆系統(tǒng)是對(duì)這些的最好的解決方案。CopyControlTM 技術(shù)整

7、合了單拷貝載體與多拷貝載體的優(yōu)點(diǎn)。單拷貝載體能提高片段的穩(wěn)定性，而且拷貝載體能在誘導(dǎo)劑的作用下，即時(shí)擴(kuò)增出高拷貝數(shù)的克隆而獲得高產(chǎn)量的 DNA。四、將組 DN段連接入載體使用連接酶把上述大小合適的 DN段連接入載體。centre 的商業(yè)化載體已經(jīng)經(jīng)過預(yù)處理，可以直接使用，無需內(nèi)切酶消化及脫磷酸化處理。連接酶可以選用centre Fast-Link DNA Ligase，連接快、效率高。連接反應(yīng)體系以 100ul 為宜。注意：BAC 載體連接完以后，需要將連接產(chǎn)物做脫鹽處理，除去連接反應(yīng)緩沖液里的鹽分。脫鹽可以用centre的 Agarose Cone方法，省時(shí)省力，防止 DNA 被剪切。五、將

8、重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞如果使用centre 試劑盒構(gòu)建黏粒文庫，需要用centreMaxPlax Lambda Packaging Extracts 來包裝上述的連接反應(yīng)產(chǎn)物，測定包裝好的黏?？寺〉牡味?，然后轉(zhuǎn)染centre300-T1?Plating Strain。挑出重組子，鑒定片段的大小。如果文庫的大小和質(zhì)量都令人滿意的話,就可以鋪板進(jìn)行文庫篩選，或者擴(kuò)增、保存文庫。如果使用centre 試劑盒構(gòu)建 BAC 文庫，應(yīng)選擇電轉(zhuǎn)法，可以選擇centre TansforMaxTM300TMpetent E.coli 作為宿主，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌，涂板長出克隆后。獲得克隆，研究者需要對(duì) BAC 克隆的大小進(jìn)行評(píng)估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。centre 文庫構(gòu)建試劑盒中的Lyse 和Blue，快速裂解克隆并電泳，可以方便的鑒定出 BAC 克隆的大小，從而估計(jì)出 BAC文庫的大小。如果文庫大小合適，那么這個(gè)文庫就可以進(jìn)行后續(xù)的操作了。六、文庫克隆數(shù)的確定組 DNA 文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經(jīng)驗(yàn)公式來確定：N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P 是希望得到的覆蓋率，f 是片段大小與組 DNA 大小的比值，N 是所需的克隆數(shù)。舉例來說，用 BAC 載體構(gòu)建人類組文庫，人類組大小為 3 x109 b