分子生物學(xué)L1-L6 問(wèn)題及答案(共16頁(yè))

1、L1 1. Nucleic acid is the genetic material (to explain via four examples)(1)DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)：細(xì)菌轉(zhuǎn)化(zhunhu)實(shí)驗(yàn)為DNA是遺傳物質(zhì)提供了首要證據(jù)。從第一個(gè)菌株抽提DNA，然后加入到第二個(gè)菌株中，能使遺傳特性從一個(gè)細(xì)菌菌株傳遞到另一個(gè)菌株。肺炎球菌屬能引起肺炎導(dǎo)致老鼠死亡，其莢膜多糖有S型和R型兩種，S型肺炎球菌能與活的S型菌一樣，能同時(shí)殺死老鼠，這說(shuō)明其中存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，這種轉(zhuǎn)化物質(zhì)純化(chn hu)后發(fā)現(xiàn)是DNA，所以DNA是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。(2) DNA是病毒(bngd)的遺傳物質(zhì)：噬菌體感染大

2、腸桿菌的實(shí)驗(yàn)證明DNA是病毒的遺傳物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌的DNA和蛋白質(zhì)組分被標(biāo)記上不同的放射性同位素32P及35S時(shí)，實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)僅有DNA被傳遞到感染細(xì)菌所產(chǎn)生的子代噬菌體中，這就很好的證明了DNA是病毒的遺傳物質(zhì)。(3) DNA也是動(dòng)物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)：當(dāng)DNA加入到某種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真核單細(xì)胞生物群落中，核酸就會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞中去，其中有一部分就會(huì)合成出一些新的蛋白質(zhì)。例如胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的合成實(shí)驗(yàn)，DNA被導(dǎo)入受體細(xì)胞中后，便成為受體細(xì)胞的一部分，與其他部分按相同的方式遺傳，導(dǎo)入DNA的表達(dá)將使細(xì)胞產(chǎn)生一些新的特性，初期這些實(shí)驗(yàn)僅僅在那些培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單細(xì)胞中獲得了成功。現(xiàn)在人們已經(jīng)成功的通

3、過(guò)顯微注射技術(shù)將DNA導(dǎo)入老鼠的受精卵并使之成為其遺傳物質(zhì)的一個(gè)穩(wěn)定的組成部分。這些實(shí)驗(yàn)直接說(shuō)明DNA不僅是真核生物的遺傳物質(zhì)，而且能夠在不同物種間相互轉(zhuǎn)移并保持功能活性。(4)有一些病毒如煙草花葉病毒（TMV）等就使用另一種核酸核糖核酸（RNA）作為遺傳物質(zhì)，其化學(xué)組成結(jié)構(gòu)與DNA只是略有不同。煙草TMV重建實(shí)驗(yàn)很好的說(shuō)明了RNA在生命體中起著相同的作用。由此可見，遺傳物質(zhì)的本質(zhì)就是核酸。實(shí)際上，除了一些RNA病毒外，其余生物的遺傳物質(zhì)都是DNA。2.(1)3即一個(gè)核苷酸中五碳糖第3個(gè)C原子所連接的羥基端，它可與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵。 (2)5即一個(gè)核苷酸中五碳糖

4、第5個(gè)C原子所連接的磷酸端，它可與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵。3.(1)A：腺嘌呤（Adenine） (2)C：胞嘧啶（Cytosine）(3)T：胸腺嘧啶(m dn)（Thymine）(4)G：鳥嘌呤（Guanine），4. Melting temperature：DNA的熔解溫度。是指通過(guò)加熱由雙鏈變?yōu)閱捂溸@一系列溫度的位于(wiy)中部的那一點(diǎn)(y din)。 5. Spontaneous mutations：自發(fā)突變。凡自然界中發(fā)生的突變，不管其產(chǎn)生原因是由于DNA復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤還是環(huán)境的損傷，都統(tǒng)稱為自發(fā)突變。6.Transition：轉(zhuǎn)換。即指一種嘧啶被另一種嘧

5、啶代替，一種嘌呤被另一種嘌呤代替，G-C對(duì)被A-T對(duì)替換，或者相反。Transversion：顛換。即嘌呤被嘧啶代替或者相反，因此A-T對(duì)變成了T-A或C-G。7.Hotspot：突變熱點(diǎn)。是突變發(fā)生頻率高的位點(diǎn)或重組頻率高的位點(diǎn) 。8.Modified bases：修飾堿基。是除了那些在DNA(T、C、A、G)、RNA(U、C、A、G) 合成時(shí)的四種通用堿基之外的一些堿基，由核酸合成后修飾產(chǎn)生。9.Denaturation：變性。描述DNA從雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湹臓顟B(tài)，鏈分開的過(guò)程經(jīng)常伴隨著加熱過(guò)程。10.Hybridization：雜交。RNA和DNA鏈互補(bǔ)配對(duì)形成RNA-DNA雜合鏈的過(guò)程。1

6、1.Renaturation(annealing)：復(fù)性。DNA雙螺旋分子變性后的互補(bǔ)單鏈再結(jié)合成雙鏈的過(guò)程。 12.如何理解結(jié)構(gòu)決定功能（舉2個(gè)以上的實(shí)例說(shuō)明）L2(1) Viroid：類病毒。是一類沒有(mi yu)蛋白質(zhì)外殼包裹的、僅具有小分子量環(huán)狀單鏈RNA的植物(zhw)病毒。 (2) PSTV：（potato spindle tuber virus）土豆(tdu)紡錘體管狀病毒。由359個(gè)核苷酸組成的單鏈閉合環(huán)狀RNA，分子中包括26個(gè)由堿基配對(duì)組成的雙螺旋區(qū)和27個(gè)單鏈內(nèi)環(huán)，呈棒狀，沒有折疊的三級(jí)結(jié)構(gòu)。(3) Prion：朊病毒。是一種蛋白質(zhì)樣感染因子，不含核酸但表現(xiàn)出可遺傳的特

7、性。例如PrPSC，羊騷癢病和牛海綿體腦病。PrPC朊病毒相關(guān)蛋白（prion related protein）。正常腦組織中產(chǎn)物，并可被蛋白酶完全水解，是28kD的疏水性球狀蛋白。PrPSC被感染腦組織中的產(chǎn)物，不能被蛋白酶水解。(4)Scrapie (羊瘙癢病)：羊瘙癢病是由蛋白質(zhì)組成的感染劑。(5) allele：等位基因。是指位于染色體同一位置分別控制兩種不同性狀的基因。如基因型Aa，A和a就互為等位基因。(6) How to assign mutations to genes via the cis/trans test (give an example)? 通過(guò)順?lè)丛囼?yàn)如何將突變分

8、配給基因(jyn)？（舉一例）互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可以用來(lái)決定兩個(gè)突變(tbin)是否存在于相同基因或不同基因中，該實(shí)驗(yàn)包括構(gòu)建包含兩種突變的雜合子。互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，如果兩個(gè)突變位于同一條基因中，可看到在反式和順式配置中，存在著不同的表型。反式配置是突變型的，因?yàn)槊恳粭l等位基因都有（不同的）突變；但順式配置是野生型的，因?yàn)橐粭l等位基因有兩個(gè)突變，而另一條等位基因就沒有突變。實(shí)驗(yàn)組中，如果兩個(gè)突變位于不同的基因中，我們總能看到野生型，因?yàn)槊織l基因總有一條野生型和一條突變型等位基因，且配置是不相關(guān)的。因而，不能互補(bǔ)意味著兩個(gè)突變是處于同一遺傳單位內(nèi)，不能互相補(bǔ)償?shù)耐蛔儽徽J(rèn)為組成了一部分相同的互補(bǔ)群。另一種用

9、來(lái)描述由互補(bǔ)試驗(yàn)定義的遺傳單位是順?lè)醋?，它等同于基因。這也很好的解釋了基因的互補(bǔ)性。(7) Gain-of-function mutation：功能獲得型突變(tbin)。該突變蛋白質(zhì)獲得新的活性(或功能)，這種性質(zhì)是顯性的。Null mutation：無(wú)效突變。該突變使基因的活性完全消失，因?yàn)樵摶蛞驯粍h除。Loss-of-function mutation：功能喪失型突變。即該突變使某一基因失活，這種性質(zhì)是隱性的。Leaky mutants：遺漏突變。突變后基因仍存在部分功能，因?yàn)橥蛔兒蟮牡鞍踪|(zhì)存在部分活性(錯(cuò)義突變)，或者因?yàn)楫a(chǎn)生了少量的野生型蛋白質(zhì)(無(wú)義突變)。(此突變不影響表型，功能

10、并不是必需的)。(8) Each allele has a different phenotype, why (illustrate by example)? 為什么每個(gè)等位基因都有一種不同的表型（請(qǐng)例證）基因座可有許多不同的突變等位基因，復(fù)等位基因的存在可允許雜合子發(fā)生任何形式的等位基因組合。如果每一種變化都產(chǎn)生一個(gè)隱性突變，并且它會(huì)阻止活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，那么一條基因內(nèi)就會(huì)有很多這樣的突變。多種可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸替換均能有效地減弱它的功能。同一條基因的變異體稱為復(fù)等位基因，它們的存在使突變體之間能夠形成雜合子，這些復(fù)等位基因之間的關(guān)系有各種形式。除了最簡(jiǎn)單的情況外，通常一系列等位基因往

11、往具有不同的表型。例如，黑腹果蠅的w基因座上有一系列的等位基因所表現(xiàn)的從紅眼一直到白眼的多種眼色，其顏色從深到淺均有。在黑腹果蠅控制眼色的w基因座的雜合子中，紅色（野生型）相對(duì)于其他基因來(lái)說(shuō)是顯性的，它們有很多不同的突變等位基因，盡管一些突變基因并未產(chǎn)生眼睛顏色，但是一些基因產(chǎn)生了顏色。因此，每一種突變等位基因代表了該基因的不同突變，這些突變不會(huì)完全破壞基因的功能，而會(huì)保留一定的活性，由此會(huì)產(chǎn)生特征性的表型。 (9) The specificity determines the blood group for human (illustrate by example) . 決定人類血型的特異性

12、（舉例(j l)闡述）基因座可能會(huì)有不止一條野生型等位基因，即基因座可能會(huì)有等位基因的多態(tài)分布，而無(wú)任何一條等位基因可以被認(rèn)為(rnwi)是野生型的。在任何一個(gè)遺傳位點(diǎn)上并非一定要有一個(gè)野生型基因。人類血型系統(tǒng)的比較就提供了一個(gè)例子，ABO血型基因座編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性決定了血型的差別。功能缺失(qu sh)可由空白型表示，即O型。但是功能性的A型和B型是共顯性的，并且對(duì)O型表現(xiàn)出顯性。在所有的個(gè)體中都產(chǎn)生O型或者H型抗原，它們含有特殊的碳水化合物基團(tuán)連接到蛋白質(zhì)。ABO等位基因編碼一種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠在O抗原加上糖基，其特異性決定了血型。A、B等位基因表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶并利用相應(yīng)的

13、碳水化合物輔因子產(chǎn)生了A、B抗原，O等位基因無(wú)法表達(dá)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移酶，因此O抗原沒有發(fā)生修飾。但A和B都不能被認(rèn)為是野生型的，因?yàn)樗麄儽磉_(dá)出一種功能，而沒有存在功能缺失或者新功能的產(chǎn)生。這種現(xiàn)象，即一個(gè)群體中存在多條功能型等位基因，被稱為多態(tài)性。L3 (1) DMD：杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy）。是一種肌肉退化失調(diào)疾病，X染色體連鎖疾病。(2) DHFR：二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase）。哺乳動(dòng)物的DHFR基因較大，含有6個(gè)外顯子，相當(dāng)于2000個(gè)堿基的mRNA，但是由于內(nèi)含子較大，使得DNA的長(zhǎng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于mRNA。哺乳

14、動(dòng)物的該基因具有相似的構(gòu)成，即它有較短的外顯子和較長(zhǎng)的內(nèi)含子，但相應(yīng)的內(nèi)含子之間的長(zhǎng)度變化廣泛。 (3)Conservation of exons and its application：外顯子就是在DNA序列中被轉(zhuǎn)錄成mRNA片段的一段序列。外顯子序列通常處于編碼氨基酸序列的選擇壓力下，因而它們很少發(fā)生變化，且很多改變不影響密碼子意義，同時(shí)其不利突變可因不利選擇而被有效地去除，因而它在進(jìn)化中具有保守性。應(yīng)用：通過(guò)外顯子的保守性可以分離基因。通過(guò)確定那些在許多生物中都存在的序列片段可以鑒定編碼區(qū)域，而外顯子的保守性可以作為這種鑒定的基礎(chǔ)。許多生物中含有這樣功能保守的基因區(qū)域，這些代表蛋白質(zhì)的序

15、列應(yīng)當(dāng)具有兩個(gè)特性：它必須有一個(gè)開放閱讀框 (ORF)；在其他生物中很可能存在與它相關(guān)的序列。這些特征就可以用來(lái)分離基因。在鑒定一些具有醫(yī)學(xué)意義的基因時(shí)，一種可行方法已經(jīng)被證實(shí)：從一定區(qū)域中篩選相對(duì)短的片段，尋找具有上述兩個(gè)特性的保守基因。(4)translocation：易位。染色體片段(pin dun)位置的改變稱為易位（用t表示），它伴有基因(jyn)位置的改變。(5)Chromosome walking and its application：染色體步移。即從第一個(gè)重組克隆插入片段的一端分離出一個(gè)片段作為探針從文庫(kù)中篩選第二個(gè)重組克隆，該克隆插入片段含有與探針重疊的順序和染色體的其他順

16、序。從第二個(gè)重組克隆的插入片段再分離出末端小片段篩選第三個(gè)重組克隆，如此重復(fù)，得到一個(gè)相鄰的片段，等于在染色體上移了一步。該技術(shù)(jsh)通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，從而慢慢靠近目的基因。應(yīng)用：染色體步移技術(shù)是一種重要的分子生物學(xué)研究技術(shù)，使用這種技術(shù)可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列，即側(cè)翼序列。染色體步移技術(shù)主要有以下幾方面的應(yīng)用：根據(jù)已知的基因或分子標(biāo)記連續(xù)步移，獲取人、動(dòng)物和植物的重要調(diào)控基因，可以用于研究結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)控。如分離克隆啟動(dòng)子并對(duì)其功能進(jìn)行研究；步查獲取新物種中基因的非保守區(qū)域，從而獲得完整的基因序列；鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，鑒定基因

17、槍轉(zhuǎn)基因法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點(diǎn)等；用于染色體測(cè)序工作中的空隙填補(bǔ)，獲得完整的基因組序列；用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接。(6)exon trapping and its application：外顯子捕獲技術(shù)。即通過(guò)對(duì)基因組片段迅速掃描從而得知外顯子的存在的一種技術(shù)。應(yīng)用：外顯子捕捉技術(shù)用了一種特殊的載體，它要求這種載體帶有強(qiáng)啟動(dòng)子且在兩個(gè)外顯子之間只有一個(gè)內(nèi)含子，當(dāng)這個(gè)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的含有兩個(gè)外顯子序列的RNA。如果基因組片段中含有一個(gè)外顯子，那么它的序列可以在細(xì)胞質(zhì)RNA中被發(fā)現(xiàn)，但如果基因組片段中只由內(nèi)含子中的序列組成，那么剪接就不會(huì)發(fā)

18、生，且mRNA也不會(huì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。(7) 5-UTR、3-UTR：5-UTR從mRNA起點(diǎn)的甲基化鳥嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子。3-UTR從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。globin：珠蛋白。具有攜帶氧能力的蛋白質(zhì) Rubisco：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶。是一種酶(EC 9)，分子量約為53kD，由8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基組成，是光合作用中決定(judng)碳同化速率的關(guān)鍵酶。Whats the function of the Rubisco and why it can be used for animals?L4(1) shot-gun

19、approach：鳥槍法。在進(jìn)行基因(jyn)克隆的第一步，基因組DNA的片段化時(shí)，如果待克隆(k ln)的給體材料是雙鏈的基因組DNA，有好幾種方法都可以用來(lái)制備片段化的DNA群體。其中最簡(jiǎn)單的一種辦法是利用限制酶消化給體基因組DNA。這種消化產(chǎn)物，不經(jīng)過(guò)凝膠電泳分部分離，就直接用來(lái)同載體分子作連接反應(yīng)的克隆方法，叫做鳥槍法(shot-gun approach)。(2)銜接物：是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。(3)末端轉(zhuǎn)移酶：（Terminaltransferase,TdT）是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到

20、DNA分子的3羥基端。(4) Saccharomyces cerevisiae：釀酒酵母，又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，釀酒酵母還是第一個(gè)完成基因組測(cè)序的真核生物，它在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類，它的細(xì)胞為球形或者卵形，直徑510 m，繁殖的方法為出芽生殖。(5) C. elegans：秀麗隱桿線蟲，是一種可以獨(dú)立生存的線蟲，長(zhǎng)度約1mm，生活在溫度恒定的環(huán)境中。C. elegans大部分是雌雄同體個(gè)體，其基因組很小且與原核生物相似

21、。它被做為一種模式生物被大量應(yīng)用于現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)的研究中，尤其在研究細(xì)胞分化方面特別有貢獻(xiàn)，而且是第一個(gè)基因組完全被測(cè)序的多細(xì)胞生物。(6)非互補(bǔ)粘性(zhn xn)末端DNA分子間的連接(linji)方法。具有非互補(bǔ)粘性(zhn xn)末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過(guò)專門作用于單鏈DNA的Sl核酸酶處理變成平末端之后，可以使用T4 DNA連接酶進(jìn)行有效連接?？梢允褂酶郊鱼暯游锏霓k法來(lái)提高平末端間的連接作用的效率。銜接物是一種用人工方法合成的DNA短片段，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在其要連接的受體DNA上并不存在的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。如果要連接的是具有非互補(bǔ)的粘性末端的載體分子和外源DNA片段

22、，可先用Sl核酸酶除去粘性末端，形成平末端的片段，便可按平末端連接法分別給它們加上相同的一段銜接物。如此帶有銜接物的載體分子和外源DNA片段，隨后再用只在銜接物中具有的唯一識(shí)別位點(diǎn)的限制酶切割，結(jié)果就會(huì)產(chǎn)生出能夠彼此互補(bǔ)的粘性末端。這樣就可以按照常規(guī)的辦法，用T4 DNA連接酶將它們連接起來(lái)。此外，應(yīng)用附加接頭或同聚物加尾技術(shù)也能夠有效地連接DNA分子。(7) How to prevent the formation of circular molecule for linear vector？如何阻止線性載體形成環(huán)化分子？阻止經(jīng)限制酶切割后的線性載體分子自身的再環(huán)化作用，可以提高DNA片段的

23、插入效率。目前阻止線性載體形成環(huán)化分子通用的方法有三種：第一，用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產(chǎn)生的線性載體分子；第二，使用同聚物加尾連接技術(shù)；第三，應(yīng)用柯斯質(zhì)粒。 (8) gene amplification：基因擴(kuò)增。是指帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)成之后，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞進(jìn)行繁殖，從而獲得大量的單一的重組體DNA分子的過(guò)程。(9) transformation：轉(zhuǎn)化。在基因操作中，感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過(guò)程。(10) How to clone the gene via complementation?如何通過(guò)互補(bǔ)作用克隆基因？（舉例）如果被克隆的D

24、NA片段，同重組體DNA分子的寄主細(xì)胞的染色體DNA是同源的，那么使用互補(bǔ)作用進(jìn)行基因克隆，是一種十分有效的方法。它的一種最簡(jiǎn)單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫(kù)”，即一組含有大腸桿菌基因組全部DNA序列結(jié)構(gòu)的重組體DNA分子的異源群體，導(dǎo)入一種大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的受體細(xì)胞。然后將此受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的底物的基本培養(yǎng)基上。因此，只有那些獲得了營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會(huì)長(zhǎng)成轉(zhuǎn)化子菌落，從而得到目的DNA片段克隆。例如a-互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，由a-互補(bǔ)產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在有生色底物X-Gal存在(cnzi)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而

25、，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，導(dǎo)致無(wú)a-互補(bǔ)功能的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱藍(lán)白篩選。(11) How to produce cDNA library?如何構(gòu)建(u jin)cDNA文庫(kù)？cDNA克隆的基本過(guò)程(guchng)是通過(guò)一系列的酶催作用，使總poly(A) mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)，如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫(kù)。其具體步驟如下：分離細(xì)胞總RNA，然后從中純化出主要含mRNA的部分。一段僅由脫氧胸腺嘧啶核苷酸組成的寡聚核苷酸oligo

26、(dT)，能夠同惰性物質(zhì)如纖維素（或瓊脂糖）結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞總 RNA制劑通過(guò)已用oligo(dT)處理過(guò)的纖維素柱時(shí)，mRNA分子的pol(A)尾巴便會(huì)同oligo(dT)序列雜交而粘附到柱子的填充物纖維素上，而其余的rRNA及tRNA分子則流出柱子。經(jīng)過(guò)處理，可從纖維素柱子中洗脫下了純凈的mRNA分子。合成第一鏈 cDNA。其中一種方法叫做oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法。另外一種叫做隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法（randomly primed cDNA synthesis）。此法的基本原理是，根據(jù)許多可能的序列，合成出610個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核昔酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的

27、引物。在這種情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生。將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子?？刹捎米晕乙龑?dǎo)合成法或置換合成。將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞增殖。重組的方式是先用末端轉(zhuǎn)移酶給雙鏈cDNA分子加尾，或者更常用的是將人工合成的銜接物加到雙鏈cDNA分子的兩端，爾后再同經(jīng)適當(dāng)處理而具有相應(yīng)末端的載體分子連接。將如此構(gòu)成的重組體分子導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，于是便得到了所需的cDNA文庫(kù)。(12) How to clone gene for genome?如何克隆基因組DNA？基因組DNA克隆與cDNA克隆不同，它

28、的出發(fā)材料是基因組DNA。由于cDNA分子比較小，可以在質(zhì)粒載體上克隆。高等(godng)真核生物染色體基因組DNA的基因文庫(kù)，通常是用噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體(zit)構(gòu)建的。應(yīng)用(yngyng)噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。第一步是，從給體生物制備基因組DNA，并用限制酶消化法產(chǎn)生出適于克隆的DNA片段。然后，在體外將這些DNA片段同適當(dāng)?shù)氖删w連接成重組體分子，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞中去。最后，從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的克隆。應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。為了使真核基因組DNA克隆到柯斯質(zhì)粒載體上，需用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A局部消化基因組DNA。然后分離收集分子量為3545

29、kb的片段群體，并同線性化處理的柯斯質(zhì)粒載體DNA連接重組。經(jīng)體外包裝之后，感染給大腸桿菌寄主細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，柯斯質(zhì)粒載體按質(zhì)粒特性進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，形成基因組文庫(kù)。L51.Plasmid：質(zhì)粒。是一類在細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA。Phage：噬菌體。它是一種感染大腸桿菌寄主細(xì)胞的溫和噬菌體，已成為主要的基因克隆載體，可以攜帶較長(zhǎng)的外源DNA片段，其最大容量為18-22kb。線性噬菌體分子的兩端各有一條由12個(gè)核苷酸組成的彼此互補(bǔ)的單鏈延伸末端，由這段粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)域叫cos位點(diǎn)。Cosmid：柯斯質(zhì)粒。一類人工建造的，含有噬菌體DNA的cos位點(diǎn)和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒

30、載體，其DNA可以在體外被包裝到噬菌體的外殼內(nèi)。所以柯斯質(zhì)粒兼具噬菌體與質(zhì)粒載體的特性，具有高容量的克隆能力，可用于克隆大片段的DNA分子，它克隆外源DNA的片段約為35-45kb。2.舉例闡述互補(bǔ)作用基因克隆。（參見L4）3.利用cDNA克隆某基因(舉例)。cDNA克隆的基本過(guò)程是通過(guò)一系列的酶催作用，使總poly(A) mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含著所有基因編碼序列的cDNA基因文庫(kù)。例如，具有poly(A)的mRNA在oligo(dT)引物和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可合成出雙鏈cDNA。隨后將它與質(zhì)粒載體構(gòu)

31、成重組分子，并轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用這種方法能夠分離和擴(kuò)增我們所期望研究的基因或DNA片段。4.GATC：即同尾酶酶切后產(chǎn)生(chnshng)的粘性(zhn xn)末端GACT序列。同尾酶是一組來(lái)源不同，識(shí)別序列各異，但能夠切割(qig)形成相同粘性末端GACT序列的限制性內(nèi)切酶。例如BamHI、BglI和Sau3A即是一組同尾酶。5.舉例說(shuō)明基因定位克隆的使用?；蚨ㄎ豢寺。╩ap-based cloning）是用于分離其編碼產(chǎn)物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。舉例如下：具體的步驟是先將目的基因，亦即目的基因的突變定位到染色體上，并在目的基因的兩側(cè)確定一對(duì)緊密連鎖的RFLP

32、或RAPD分子標(biāo)記；接著利用最緊密連鎖的一對(duì)兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來(lái)；最后是根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因。成功地應(yīng)用基因定位克隆技術(shù)分離目的基因的兩個(gè)必要條件是，以酵母人工染色體YAC（yeast artificial chromosome）為載體構(gòu)建含有大片段DNA的YAC庫(kù)；另一個(gè)必要條件是要有可用的同目的基因緊密連鎖的DNA探針。6. genome：基因組。即生物體所擁有的全部DNA序列，包括所有的基因及基因間的序列。因此，基因組應(yīng)該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全

33、部 HYPERLINK /view/758.htm t _parent DNA分子。（說(shuō)的更確切些，核基因組是單倍體 HYPERLINK /view/32286.htm t _parent 細(xì)胞核內(nèi)的全部 DNA分子； HYPERLINK /view/19423.htm t _parent 線粒體基因組則是一個(gè)線粒體所包含的全部DNA分子； HYPERLINK /view/28826.htm t _parent 葉綠體基因組則是一個(gè)葉綠體所包含的全部DNA分子）。 7. genetic map（linkage map）：根據(jù)遺傳重組實(shí)驗(yàn)的重組頻率結(jié)果繪制的，用來(lái)表示同一條染色體上不同基因（或特

34、定DNA序列區(qū)）之間的排列順序及其相對(duì)距離的線性圖，叫做遺傳圖譜或連鎖圖譜。8. genetic polymorphism：遺傳多態(tài)性。即在一個(gè)基因座上有多條等位基因的現(xiàn)象。9.SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism），它是指來(lái)自不同生物有機(jī)體基因組DNA同一部位上的單個(gè)核苷酸的差異，是第三代分子遺傳標(biāo)記。10.蛋白組學(xué)研究中所用的方法及原理。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中以前最常用的方法是二維電泳（2DE），二維電泳的第一維過(guò)程中，利用等電聚焦原理，蛋白質(zhì)依其等電點(diǎn)的不同被分離開來(lái)，第二維的過(guò)程是用SDS將蛋白質(zhì)依分子量的不同加以分離，電泳結(jié)束后可將膠片以銀

35、染或考馬斯亮藍(lán)染色，讓蛋白質(zhì)顯現(xiàn)出來(lái)。目前(mqin)基于色譜分離(fnl)與質(zhì)譜的大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的中心(zhngxn)。這種技術(shù)可以大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)質(zhì)譜儀把蛋白質(zhì)或肽段的組成信息以一級(jí)圖譜與二級(jí)圖譜的形式表現(xiàn)出來(lái)，最后把這些圖譜與蛋白質(zhì)或肽段產(chǎn)生的理論圖譜相比較確定相似性（也即搜庫(kù)），并最終確定樣品中包含那些肽段，并通過(guò)肽段與蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，最終推斷樣品中包含的蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)（比較蛋白質(zhì)組學(xué)）也獲得了廣泛研究。它不僅檢測(cè)基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，而且要檢測(cè)其表達(dá)蛋白質(zhì)的含量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容可以說(shuō)是蛋白質(zhì)定量技術(shù)

36、，而這種技術(shù)是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要途徑。例如Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)，其原理是利用DeCyder MSTM軟件對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由譜峰形式轉(zhuǎn)化為直觀的類似雙向凝膠的圖譜，譜圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)肽段，而不是蛋白質(zhì)，再比較的不同樣本上相應(yīng)肽段的強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。 12.限制性位點(diǎn)能否體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性。限制性位點(diǎn)能體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性，限制位點(diǎn)多態(tài)性的遺傳規(guī)律符合孟德爾定律。兩個(gè)個(gè)體之間的限制圖譜的不同稱作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP）?；旧希粋€(gè)RFLP 就是一個(gè)SNP，只是這個(gè)SNP位于一個(gè)酶切位點(diǎn)中，它能夠與任何其他遺傳標(biāo)記一樣，也可同樣

37、用來(lái)作為遺傳標(biāo)記。只是它檢測(cè)的不是一些特征性表型，而是通過(guò)檢測(cè)限制圖譜來(lái)直接揭示基因型。已有實(shí)驗(yàn)很好的證明了限制性位點(diǎn)能體現(xiàn)孟德爾遺傳的特性，書上展示了一個(gè)祖孫三代的限制性多態(tài)家譜，那個(gè)圖譜表明了DNA 分子標(biāo)記片段的孟德爾分離規(guī)律，在所有可能的配對(duì)重組中，某個(gè)限制標(biāo)記的4條等位基因都能找到，并且它們都可以在每一代中獨(dú)立地分離。 13.RFLP可以作為一種遺傳標(biāo)記。RFLP，即DNA限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性，它是指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，所產(chǎn)生出來(lái)的DNA片段在長(zhǎng)度上的簡(jiǎn)單變化。由于核酸內(nèi)切限制酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來(lái)自一個(gè)完整的純合子個(gè)體（所有的基因及DNA

38、序列）的每一種同源的DNA分子，都會(huì)在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確地切割。從不同的生態(tài)型或不同的地理隔離群植株分離的總DNA中，同源DNA分子通常會(huì)表現(xiàn)出序列的趨異性，形成RFLP。這些RFLP是由于DNA序列上的特定變化（突變）引起的，因此它們也能夠像其他任何遺傳標(biāo)記一樣進(jìn)行定位，成為一種十分有用的分子標(biāo)記。基本上，一個(gè)RFLP 就是一個(gè)SNP，只是這個(gè)SNP位于一個(gè)酶切位點(diǎn)中，它能夠與任何其他遺傳標(biāo)記一樣，也可以同樣用來(lái)作為遺傳標(biāo)記。只是它檢測(cè)的不是一些特征性表型，而是通過(guò)檢測(cè)限制圖譜來(lái)直接揭示基因型。14.genetic markers：通過(guò)一定方法可以識(shí)別、并可遺傳(ychun)的指標(biāo)或性狀就叫遺

39、傳標(biāo)記。其特點(diǎn)是它可與被標(biāo)記基因同時(shí)遺傳。15.目前遺傳研究中所使用用的四類(s li)遺傳標(biāo)記。Morphological markers(形態(tài)學(xué)標(biāo)記(bioj) (Plant height，leave color and shape)； Cytological markers (細(xì)胞學(xué)標(biāo)記) (Nuclear type，triplet)；Biochemical markers (生化標(biāo)記) (Soluble protein，isozyme)；Molecular markers (分子標(biāo)記) (DNA，RNA，rRNA)。16.SSR:（Simple Sequence Repeat）簡(jiǎn)單重復(fù)

40、順序，即微衛(wèi)星DNA標(biāo)記；RAPD:（Randomly Amplified Polymorphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；AFLP:（Amplified Fragment Length Polymorphism）即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性；Satellite: 即衛(wèi)星DNA（重復(fù)單位為幾百-幾千堿基對(duì)）；MS: Microsatellite: 即微衛(wèi)星DNA (重復(fù)單位為2-5堿基對(duì)）；Satellite DNA：衛(wèi)星DNA。是位于真核細(xì)胞染色體中，由許多相同或相關(guān)的短小重復(fù)序列高度串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列區(qū)。它主要存在于染色體的著絲粒部位，通常不被轉(zhuǎn)錄。因其堿基組成中GC含量少，與染色體

41、其他部分DNA相比具有不同的浮力密度，在氯化銫密度梯度離心后呈現(xiàn)與大多數(shù)DNA有差別的“衛(wèi)星”帶而得名。Minisatellite：小衛(wèi)星DNA。是一種存在于真核生物基因組DNA中比衛(wèi)星DNA短的串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列單位長(zhǎng)度在10-100bp 之間, 且在其重復(fù)單元之間并不存在間隔序列。Microsatellite：微衛(wèi)星DNA。它是存在于真核基因組DNA中的一種具有比小衛(wèi)星DNA更短重復(fù)單元(24bp)的衛(wèi)星DNA，重復(fù)序列單位長(zhǎng)度小于10 bp(一般是2-5，最多為6) ,例如真核生物染色體末端的端粒就是一種微衛(wèi)星DNA。STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，S

42、TR），又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)。VNTR：(Variable number of tandem repeat)，即數(shù)目可變的串聯(lián)(chunlin)重復(fù)序列，又稱小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)。17.人類基因組的數(shù)目、人類蛋白質(zhì)組的成員(chngyun)，為什么后者大大多于前者。人類(rnli)基因組的數(shù)目約為3.3109bp，約含有30004000條基因，而人類蛋白質(zhì)組約有5000060000個(gè)蛋白質(zhì)成員。由此可見，盡管人類基因組只有25%是基因，而蛋白質(zhì)編碼區(qū)域只占其中的一小部分，人類蛋白質(zhì)組成員數(shù)還是大大多于人類基因組基因數(shù)。這是由于

43、存在可變剪接，所以基因的總數(shù)比潛在的蛋白質(zhì)數(shù)目少。人類的可變剪接程度比昆蟲和線蟲的大，約60%的人類基因可能存在可變剪接。因此跟其他真核生物相比，人類蛋白質(zhì)組增加的程度大于基因組增加的程度。從人類基因組其中的兩條染色體上抽出一些基因進(jìn)行可變剪接研究，我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變的基因可變剪接的比率高達(dá)80%，如此就可使得蛋白質(zhì)組的成員增加到5000060000種。 L6 1.PLoS：公共科學(xué)圖書館（Public Library of Science）。它是一個(gè)由科學(xué)家和醫(yī)生組成的非營(yíng)利機(jī)構(gòu)，致力于把世界上科學(xué)和醫(yī)學(xué)的文獻(xiàn)作為免費(fèi)資源向公眾開放。2.Redundancy：冗余。若兩個(gè)或更多個(gè)

44、基因行使著同樣的功能，那么這些基因中沒有一個(gè)基因是必需的。4.RNA saturation hybridization (RNA-driven hybridization)：RNA飽和雜交試驗(yàn)(RNA saturation hybridization)，它可以求出在非重復(fù)序列DNA中能與mRNA 雜交部分的百分率。將少量非重復(fù)序列DNA變性后與過(guò)量mRNA混合，使每個(gè)與mRNA互補(bǔ)的DNA 序列都能有機(jī)會(huì)和mRNA形成雙鏈雜合體。這種雜交又叫RNA驅(qū)動(dòng)的雜交(RNA-driven hybridization)。5.Rot：即RNA濃度和反應(yīng)時(shí)間的乘積(Rot)。RNA飽和雜交試驗(yàn)的雜交程度受其制約，Rot越大，雜交就越徹底，直到趨于飽和。 6.abundance：在每一個(gè)細(xì)胞中，每一種mRNA的平均數(shù)量被稱作這個(gè)分子的豐度。4.biochip：生物芯片。指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子（比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片）、（細(xì)胞等）生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器（比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為