醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)實驗教學(xué)大綱(共6頁)

1、醫(yī)學(xué)(yxu)細胞生物學(xué)實驗教學(xué)大綱實驗一 顯微鏡的操作(cozu)與使用3學(xué)時(xush)實驗二 有絲分裂3學(xué)時實驗三 雞血細胞融合3學(xué)時實驗二 有絲分裂【目的要求】掌握動、植物細胞有絲分裂過程各期的特點及主要區(qū)別。掌握有絲分裂標本臨時壓片技術(shù)?！緦嶒炘怼考毎?jīng)過生長和分裂而完成增殖的全過程稱細胞增殖周期。不同分裂方式的細胞其增殖周期表現(xiàn)形式不同。無絲分裂是低等生物增殖的主要方式，由于其過程簡單而迅速，沒有染色體組裝、紡錘體形成等一系列變化，故又稱直接分裂。在高等動物體內(nèi)可發(fā)生在某些迅速增殖的組織f如口腔上皮)、體外培養(yǎng)細胞，創(chuàng)傷修復(fù)、病理性代償組織(傷口附近、炎癥)中。有絲分裂是高等生物

2、體細胞增殖的主要方式，由于其過程較為復(fù)雜，細胞內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的絲狀結(jié)構(gòu)(jigu)變化(染色體組裝、有絲分裂器的形成)后，細胞才進行分裂，故又稱為間接分裂?！緦嶒?shyn)用品】器材(qci)：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、眼科鑷、培養(yǎng)皿、刀片。試劑：Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)，70乙醇溶液，1molL HCl苯酚品紅染液。標本：馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖縱切片。材料：洋蔥根尖或水仙根尖。【內(nèi)容與方法】動物細胞有絲分裂觀察標本制備：馬蛔蟲子宮石蠟切片，鐵蘇木精染色。觀察：先在低倍鏡下觀察。在馬蛔蟲子宮切面上可見子宮腔內(nèi)有許多近圓形的受精卵細胞，大多處于不同的分裂時期。每個受精卵細胞

3、外均圍有一層厚的受精卵膜，它與受精卵細胞間的空隙為圍卵腔。在有些受精卵細胞外表面或受精卵膜內(nèi)可見有極體附著。注意在切片標本的幾個子宮切片中尋找和觀察處于間期和有絲分裂不同時期的細胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細觀察它們的形態(tài)變化(圖6-2)。間期(interphase)：細胞質(zhì)內(nèi)有兩個近圓形的細胞核，二為雌原核，一為雄原核。兩個原核形態(tài)相似，不易分辨。細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜完整，細胞核附近胞質(zhì)中有中心體(central body)存在。前期(prophase)：雌雄原核相互靠近，核仁(nucleolus)消失，染色質(zhì)逐漸濃縮成扭曲細絲狀染色絲(chromatin fiber)，進一步縮短變粗，形成

4、短棒狀染色體(chromosomc)。前期核膜消失，兩對中心粒(centri0le)分離，周圍出現(xiàn)星射線并分別向細胞的兩極移動。中期(metaphase)：染色體排列在細胞中央，形成赤道板(equatorialplate)。由于細胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀兩種不同圖像。側(cè)面觀染色體排列在細胞中央，兩極各有一個中心體，其周圍有星射線。中心體之間紡錘絲與染色體著絲點相連，這些結(jié)構(gòu)總稱為有絲分裂器。極面觀可見六條染色體平排于赤道面上，此時染色體已縱裂為二，但尚未分離。后期(anaphase)：縱裂后形成的子染色體在紡錘絲的牽引下分別向兩極(lingj)移動，成為相等的兩群。細胞拉長，中部的細胞

5、膜開始凹陷。末期(telophase)：兩極的子染色體逐漸解體、模糊，變成染色質(zhì)態(tài)。核膜、核仁也相繼重新出現(xiàn)，紡錘絲星射線消失，細胞膜的凹陷加深，最后(zuhu)橫縊成兩個子細胞。植物(zhw)細胞有絲分裂觀察洋蔥根尖縱切片的觀察標本制備：洋蔥根尖石蠟縱切片，鐵蘇木精染色。觀察：取洋蔥根尖縱切片標本在低倍鏡下觀察，洋蔥根尖由尖端向上可分為三個區(qū)域。根冠區(qū)：位于尖端，細胞排列較疏松的區(qū)域。生長區(qū)：位于根冠區(qū)上方，細胞方形或扁方形，排列緊密，細胞有強烈的分裂增生能力，大都處于分裂期的各個不同時期。延長區(qū)：位于生長區(qū)上方，細胞延長成長方形，細胞多處于分裂間期。先在低倍鏡下找到生長區(qū)，換高倍鏡觀察，辨

6、認處于不同分裂時期的細胞。間期：細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核形態(tài)明顯，核內(nèi)可見l一2個染色很深的核仁。前期：核膨大，核膜破裂，核仁逐漸消失，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮成纖細的染色絲并逐漸縮短變粗，形成染色體。中期：染色體排列在細胞中央平面上(赤道部)形成赤道板(洋蔥染色體為16條)，染色體己縱裂成兩條染色單體，但依然由一個著絲粒相連。細胞兩極出現(xiàn)紡錘絲，部分紡錘絲與染色體著絲點(kinetochore)后期：著絲?？v裂，染色體分為相等的兩群，在紡錘絲的牽引下移向兩極。末期：移到兩極的染色體解旋、伸長變細成為染色絲，最后形成染色質(zhì)。核膜、核仁重新出現(xiàn)，紡錘體消失。細胞中央赤道部由紡錘體微管等形成成膜體(phr

7、agmoplast)，由它再融合成細胞板(cell plate)，進而形成細胞壁，形成兩個子細胞。洋蔥根尖(或水仙根尖)臨時壓片觀察(1)標本制備：1) 取材：培養(yǎng)洋蔥(或水仙)，取根尖，將其浸入Carnoy固定液2h以上。然后保存在70乙醇溶液中(可長期保存)。軟化：觀察前取出根尖，浸在lmolL HCl溶液中軟化5一lOmin，水洗3次。3) 染色：將以上處理的根尖放在滴有一滴苯酚品紅染液的載玻片上，用眼科(yn k)鑷搗碎根尖，稍停片刻后，蓋上蓋玻片。壓片：輕壓蓋玻片，把材料(cilio)壓成均勻的薄層。用吸水紙吸干蓋片周圍的染液。(2)觀察：先用低倍鏡尋找壓片中處于分裂期的細胞。然后在

8、高倍鏡下觀察不同(b tn)分裂期的細胞。染色質(zhì)和染色體被染成紫紅色，細胞質(zhì)不著色。各期細胞形態(tài)表現(xiàn)同上?！咀鳂I(yè)】書寫實驗報告，簡述制各根尖臨時壓片步驟，并繪圖記錄洋蔥根尖有絲分裂各期細胞。繪制馬蛔蟲受精卵有絲分裂各期細胞?！舅伎碱}】簡述動物細胞與植物細胞有絲分裂有何異同。【試劑配方】苯酚品紅：融化的石炭酸25ml加入50ml 95乙醇溶液中，5g堿性品紅溶解于其中，充分溶解后過濾，4C保存。使用時用蒸餾水稀釋至500ml，成熟1周。實驗三 雞血細胞的融合兩個以上細胞合并成一個雙核或多核細胞，稱為細胞融合(cell fusion)。細胞融合包括質(zhì)膜的連接與融合，胞質(zhì)合并，細胞核、細胞器和酶等互

9、成混合體系。20世紀60年代初期，病毒誘導(dǎo)細胞融合技術(shù)的出現(xiàn)，開創(chuàng)了人工誘導(dǎo)細胞融合的新領(lǐng)域。70年代后，逐漸使用化學(xué)融合劑，它使用方便，活性穩(wěn)定，容易制備和控制，目前已成為人工誘導(dǎo)細胞融合的主要手段。80年代初,出現(xiàn)了電融合技術(shù)，它具有可控、高效、無毒的優(yōu)點，并逐漸應(yīng)用于科學(xué)研究。細胞融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)的研究。例如，細胞周期調(diào)控的研究，基因互補分析、檢測病毒，細胞對病毒敏感因素的分析、腫瘤細胞惡性分析等等。單克隆抗體技術(shù)就是通過細胞融合技術(shù)發(fā)展起來的，對生命科學(xué)的研究及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用產(chǎn)生了重大影響。本實驗主要介紹化學(xué)融合劑聚乙二醇(polyethylene

10、glycol，PEG)介導(dǎo)的細胞融合。目的要求了解(lioji)PEG誘導(dǎo)細胞融合的基本原理。通過PEG誘導(dǎo)的雞紅細胞之間的融合實驗，初步掌握(zhngw)細胞融合技術(shù)。實驗(shyn)原理PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合,在高濃度(50)的PEG溶液中自由水消失，導(dǎo)致細胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，引起細胞融合。為了發(fā)揮PEG促進細胞融合的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。本實驗材料為雞紅細胞，其核結(jié)構(gòu)緊密，易于觀察。實驗用

11、品 (1)器材：離心機、顯微鏡、天平、水浴鍋、計數(shù)板、滴管、離心管、容量瓶、廣口瓶、細口瓶、燒杯、注射器、蓋玻片、載玻片。(2)試劑：Alsever溶液、GKN溶液、0.85%鹽水、雙蒸水、Jenus green染液、50PEG。 試劑配制： 1)Alsever溶液：葡萄糖2.05g,，檸檬酸鈉0.80g, NaCl 0.42g，溶于100ml雙蒸水中。 2)0.85生理鹽水。3)GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.40g，Na2HPO42H2O 1.77g，NaH2PO4H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅(phenol red) 0.01g，溶于1000ml雙蒸水中。4)Janus g

12、reen染液。5)50PEG溶液：稱取一定量PEG(WM4000)放入燒杯，沸水浴加熱，使之熔化，待冷卻至50時，加入等體積預(yù)熱至50的GKN溶液，混勻，置37備用。（3）材料：成年雞。方法與步驟(1) 注射器內(nèi)先吸入2m1 A1sever溶液，從雞翼下靜脈取2m1雞血，注入離心管，再加入6ml Alsever溶液，使之成為14懸液。(2) 取l ml雞血懸液，加入4 m1 0.85生理鹽水，混勻平衡后，800 r/min離心3min，棄去上清液，再按上述條件離心2次。最后，棄去上清液，加GKN液4m1，離心1次。(3) 棄去上清液，加GKN液（體積比19），制成10細胞懸液。 (4) 取以上

13、懸液以血細胞計數(shù)器計數(shù)，若細胞密度過大，用GKN溶液稀釋至(34)10個/m1。(5) 取以上細胞懸液1ml于離心管，放入37(39左右更佳)水浴鍋中預(yù)熱。同時將 50 PEG液放入水浴鍋中預(yù)熱。(6) 待溫度恒定后，在1ml細胞懸液中慢慢逐滴加入0.5m1 50PEG溶液(rngy)(慢慢沿離心管壁流下融合劑)，且邊加邊搖勻，然后放入水浴鍋中。(7) 細胞融合一段時間(2030min)后，加入GKN溶液(rngy)至8m1，靜止于水浴鍋中20min左右。(8)取出離心管，800r/min離心3min，使細胞完全沉降(chnjing)。棄去上清液，加GKN溶液，再離心1次。(9)棄去上清液，加入少量GKN溶液，混勻，取少量懸液于載玻片上，加入Janus green染液，用牙簽攪勻，3min后蓋上蓋玻片，觀察細胞融合情況。觀察與結(jié)果(1)在顯微鏡下，觀察細胞融合情況，計算融合率。(2)融合率視野內(nèi)發(fā)生融合的細胞核總數(shù)視野內(nèi)所有細胞核總數(shù)100作業(yè)1書寫實驗報告，并計算融合率。 2繪