第九講超低溫保存技術(shù)

1、 超 低 溫 保 存 技 術(shù) 1超低溫保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196）中使保存的生物材料的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止，而細胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能仍保存。 這樣有利于保存和搶救物種，盡可能避免組織細胞培養(yǎng)及自然界中積累性突變等的發(fā)生，便于國際間的種質(zhì)交換。經(jīng)過超低溫保存后的再生植株，有可能產(chǎn)生高抗寒性的新材料。 超低溫保存正成為長期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源及珍貴實驗材料的一個重要方法。2 1973年，Nag和Street將胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細胞保存在液氮中一段時間，解凍后再培養(yǎng)觀察到細胞的生長。這是超低溫保存植物材料成功的首次報道。3 之后人們對超低溫保存技術(shù)的研究越來越深入，尤其對降溫

2、方法的研究。 按照待保存材料是否需要包埋，降溫方法可分為兩大類： 1 材料不需要包埋的降溫方法 2 材料需要包埋的降溫方法4 材料不需要包埋的降溫方法 1.1 慢凍法 1.2 快凍法 1.3 兩步冰凍法 1.4 逐級冰凍法 1.5 干凍法 1.6 玻璃化法 （vitrification） 5 1.1 慢凍法 慢凍法是指以0.110.min-1的速度進行降溫，只要降溫速度適宜，在冰凍保護劑作用下，即可避免在細胞脫水時細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，又能防止因溶質(zhì)含量增加引起的“溶液效應(yīng)”。 原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細胞和愈傷組織等細胞類型一致的培養(yǎng)物，采用這種方法效果較好。一般來說，降溫速度為0.52.min-1。6

3、 1.1 慢凍法 為均勻分配降溫過程中的溫度，同質(zhì)降溫待超低溫保存材料，從而減少異質(zhì)冰晶的形成，提高保存成功率，出現(xiàn)了演變于慢凍法的微滴凍存法。其方法是將含有一個莖尖的低溫保護劑溶液滴于鋁箔上，用程序降溫儀以適宜的速度（一般在0.10.2.min-1之間）將其降溫至轉(zhuǎn)移溫度（一般為-40-70），最后浸入液氮保存。 7 1.2 快凍法 快凍法即將經(jīng)0或其他溫度預(yù)處理過的材料直接放入液氮或其蒸氣相中，此種方法的降溫速度可達到3001000.min-1，也有人認為可達到1000.min-1以上。 其降溫原理：利用超速冷凍，可使細胞內(nèi)的水分迅速通過冰晶生成的危險溫度區(qū)（-140 -10），使細胞內(nèi)的

4、水分來不及形成冰晶中心，就降到-196的安全區(qū)。此時細胞內(nèi)的水為玻璃化狀態(tài)，該狀態(tài)對細胞結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生破壞作用，從而減輕或避免細胞內(nèi)結(jié)冰的危害。 8 一般認為種子、花粉、球莖、抗寒植物的枝條和冬芽等一些高度脫水的植物材料適用此法，但對液泡大、細胞含水量高的植物材料一般不適合。91.3 兩步冰凍法 它是把慢凍和快凍結(jié)合起來的一種冰凍方法。即先用較慢的速度使培養(yǎng)物降至某一溫度，停留約10min或不停留，再降到-40-30，在此溫度下保持30min1h或不停留直接投入液氮。 目前大多采用每分鐘降低0.54的速率降到-40，然后投入液氮。一般認為，停留是誘導細胞外溶液結(jié)冰，使細胞內(nèi)外產(chǎn)生蒸氣壓差，進行保護

5、性脫水，否則細胞外有可能產(chǎn)生非均勻的冰晶，對細胞會產(chǎn)生嚴重傷害。 101.4 逐步冰凍法 此法是制備不同等級溫度的冰浴如-20、-50、-70、-100或-10、-15、-23、-35、-40等使植物材料經(jīng)保護劑在0預(yù)處理后，逐漸適應(yīng)這些溫度，材料在每級溫度上停留一定時間(46min)，使細胞達到保護性脫水，然后投入液氮中. 殷曉輝通過對幾種野生稻愈傷組織冰凍保存研究，得出的降溫程序是：（1）0-10速度是1.min-1停留15min；（2）-10-40速度是1.min-1 ，停留60min；（3）-40-196。 111.5 干凍法 利用無菌風、真空、干燥硅膠、飽和鹽溶液或高濃度蔗糖等對材料

6、進行干燥預(yù)處理，然后快速將其投入液氮中保存。在進行干燥預(yù)處理時，要適度脫水和掌握好脫水速度，以增強材料的抗凍性，一般需要將植物材料的含水量由72%77%下降到27%40%后再浸入液氮中。如果是用無菌風、真空、干燥硅膠干燥不以任何冷凍保護劑處理的材料，稱為直接干燥處理。 121.6 玻璃化法 1.6.1 玻璃化法保存植物材料的原理 玻璃化法是Luyet于1937年提出的，Sakai等于1990年建立了玻璃化凍存簡單高效的技術(shù)體系。13其保存原理： 植物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護劑處理后，快速投入液氮中保存，使保護劑和細胞內(nèi)水分來不及形成冰晶或冰晶沒有足夠的時間生長，從而進入一種人工的完全玻璃化的狀態(tài)

7、。在此狀態(tài)中，水分子沒有發(fā)生重排，不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因而不會由于細胞內(nèi)結(jié)冰造成機械損傷或溶液效應(yīng)，傷害組織和細胞，保證化凍后細胞仍有活力。14 早期的快凍法和慢凍法等常規(guī)超低溫保存都是部分玻璃化法即胞內(nèi)玻璃化。對于單細胞來說，常規(guī)超低溫保存中的胞外冰晶幾乎是不具有傷害性的，但對于整個器官或組織來說，所謂的胞外冰晶仍然是在細胞的間隙中，仍會對細胞產(chǎn)生傷害。 現(xiàn)在玻璃化法凍存采取完全玻璃化法即胞內(nèi)胞外同時為玻璃化狀態(tài)，在器官和組織水平保存。對保護細胞與細胞之間的聯(lián)系方面有較好的效果。由于是完全玻璃化凍存，因此在解凍時不存在不均勻化凍現(xiàn)象。 15 1.6.2 玻璃化冰凍保護劑 在材料冰凍之前，

8、用玻璃化保護劑(Plant Vitrification Solution,PVS)處理，再投入液氮保存。常用玻璃化保護劑包括滲透性物質(zhì)和非滲透性物質(zhì)兩類。 滲透性物質(zhì)包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等，非滲透性物質(zhì)包括蔗糖、聚乙二醇等物質(zhì)。此外，脯氨酸也可作為玻璃化保護劑起到穩(wěn)定凍存細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。一般來說，復(fù)合冰凍保護劑能充分發(fā)揮各種成分的保護作用，從而產(chǎn)生累加作用，但其毒性不累加。16 目前常用的玻璃化保護劑是Sakai于1991年推出的保護劑 PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4 mol.L-1蔗糖+MS-NH4+無激素培養(yǎng)基)。 該玻璃化保護劑已

9、在多種植物材料玻璃化凍存研究中獲得成功，并有較高的再生率。 17 材料需要包埋的降溫方法 2.1 包埋脫水法(encapsulation-dehydration) 2.2 包埋玻璃化法(encapsulation-vitrification) 18 2.1 包埋脫水法(encapsulation-dehydration) 包埋脫水法最早出現(xiàn)在法國學者Fabre和Dereuddre保存馬鈴薯莖尖的研究中，它參照了人工種子的制作技術(shù)，結(jié)合超低溫保存的需要，將包埋和脫水結(jié)合起來應(yīng)用于超低溫保存中。19其基本過程： 將包含有材料的褐藻酸鈉溶液滴向高鈣溶液，因褐藻酸鈣的生成而固化成球狀顆粒，同時輔以高濃

10、度蔗糖預(yù)處理材料，使材料獲得高的抗凍力和抗脫水力后，結(jié)合適當?shù)拿撍徒禍胤绞揭旱卤４妗?02.1.1 包埋方式 包埋方式有兩種： （1）材料先用高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)后再包埋，這種方法運用較普遍，褐藻酸鈉溶液中可含或不含高濃度蔗糖。 （2）材料包埋后用更高濃度蔗糖培養(yǎng)處理，在這種方法中，褐藻酸鈉溶液中必須含更高濃度蔗糖，否則材料會重新回到低滲透狀態(tài)。212.1.2 褐藻酸鈉和蔗糖的濃度及處理時間 常用褐藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為3%，氯化鈣濃度100m mol.L-1，固化時間30min,蔗糖濃度一般為0.3 0.75 mol.L-1，其中以0.75 mol.L-1更常用。 在蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)的時間一般為1

11、d，也有310d的。 222.1.3 材料的脫水方式和保存前的含水量 包埋脫水法保存種質(zhì)的關(guān)鍵之一是尋找材料包埋后的最佳脫水方式以及材料保存前最佳含水量，只有這樣才能充分體現(xiàn)包埋這一操作步驟的優(yōu)點。包埋后的材料在保存前絕大多數(shù)采用干燥空氣脫水，但也可將包埋后蔗糖預(yù)處理后的材料用兩步法或玻璃化法作進一步的脫水保存。 對于保存前的最佳含水量，莖尖和分生組織的最佳含水量為20%40%，梨莖尖為20%，馬鈴薯莖尖為30% 。232.2 包埋玻璃化法(encapsulation-vitrification) 其基本操作程序：預(yù)培養(yǎng)和包埋玻璃化溶液脫水液氮保存化凍恢復(fù)培養(yǎng)。 這種方法實質(zhì)上是將包埋脫水法的

12、包埋和玻璃化法結(jié)合在一起，它減少了脫水的時間，簡化了凍存程序，且比包埋脫水法有更高的成芽率。 但是對某些植物而言，包埋玻璃化法不一定是最適合的，這可能與基因型有關(guān)。辣根包埋玻璃化法凍存3天后，成活率為60%，用包埋脫水法保存成活率大于90%。243 問題與展望 植物種質(zhì)超低溫保存技術(shù)具有傳統(tǒng)的原境保存和異境保存無法比擬的優(yōu)點，它不僅使保存的材料免受病、蟲的侵害，而且能長期保存生物材料。但是植物超低溫保存工作的開展時間畢竟還短，有許多問題尚需進一步研究：25（1）冰凍保護劑的選擇；（2）降溫過程中細胞超微結(jié)構(gòu)的變化；（3）保存幾十年的材料遺傳穩(wěn)定性；（4）長期連續(xù)使用凍藏的組織再生能力；（5）某一植物保存體系的建立及其普遍應(yīng)用。 這些是今后一個時期研究的重點，尤其是