產(chǎn)纖維素酶真菌的酶活測定及復核鑒定-定稿

1、產(chǎn)纖維素酶真菌的酶活測定及復核鑒定摘要：試驗中的真菌一部分來源于九寨溝的土壤中和枯枝落葉中，還有部分來自于河北遷安市及勝利油田的污染土壤中。包括ACCC31726、ACCC32491、ACCC32567、ACCC32568等共計29株菌對其進行了微生物純化、分離、篩選、酶活的測定及復核鑒定等。關(guān)鍵詞：纖維素酶活篩選真菌ITS鑒定纖維素是自然界存在量最大的一類天然資源，且可無限再生。麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。并且我國每年產(chǎn)秸稈約7億多噸，實現(xiàn)秸稈資源高效利用，是我國可持續(xù)發(fā)展面臨的重要問題。能源危機和環(huán)境危機是整個人類社會目前面臨的嚴峻問題，而合理有效的處理和利用纖維素資源

2、將為解決這些問題提供一種有效的手段。本實驗通過對菌種產(chǎn)纖維素酶活的測定確定其酶活高低，并綜合形態(tài)觀察和ITS序列分析對其進行鑒定。材料與方法1.1試驗材料1.1.1試驗菌種試驗菌種一部分來源于九寨溝的土壤中和枯枝落葉中，還有部分來自于河北遷安市及勝利油田的污染土壤中。包括ACCC31726、ACCC32491、ACCC32567、ACCC32568等共計29株菌，所有菌種均來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種中心（ACCC）。1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基馬鈴薯200.0g葡萄糖20.0g瓊脂15.020.0g蒸餾水1000.0mLpH自然馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30.0min,然后用紗布

3、過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000.0mL羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMCNa）NH4NO31.0gMnSO40.004g HYPERLINK l bookmark4 MgSO47H2O0.5g瓊脂20gKH2PO41.0gZnCl20.0017g HYPERLINK l bookmark10 FeSO40.01g蒸餾水1000mlKCl0.5gCoCl20.002gCMCNa10gpH6.5羧甲基纖維素液體培養(yǎng)基（同羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基配方，不加瓊脂）液體發(fā)酵培養(yǎng)基玉米秸稈粉（40目）10.0g麩皮2.5gKH2PO41.5g（NH4）2SO41.3gK2HPO43H202.9gCaCl

4、20.15gMgCl21.0gFeSO40.005gMnSO40.0061gNaCl1.0g蒸餾水1000mL1.1.3主要試劑1.0%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：2g羧甲基纖維素鈉（粘度300600里泊）溶于200.0mL蒸餾水中，水浴加熱至溶解，用一層紗布過濾，取濾液100.0mL加pH4.8的醋酸鹽緩沖液20.0mL，再加蒸餾水410.0mL，貯冰箱備用。一周后應重新配制。3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS）制備：將6.3g3,5-二硝基水楊酸和2.0mol/LNaOH溶液262.0mL，加到500.0mL含有185.0g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5.0g結(jié)晶酚和5.0g亞硫酸鈉，攪

5、拌溶解。冷卻后用蒸餾水定容至1000.0mL，貯于棕色瓶中，半個月后使用。pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液：11.8mL冰醋酸定容至100.0mL，稱取27.2g的醋酸鈉溶解并定容至100.0mL，將上述兩種溶液等體積混合。1%水楊苷溶液：1g的水楊苷溶液加少許pH6的緩沖液,，再用pH6的緩沖液定容至100mL。1mg/mL剛果紅、水楊苷、whatmanNO.1試紙、1mg/mL的葡萄糖標準液、羥基纖維素鈉、葡萄糖、苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）、無水乙醇（預冷）、70%乙醇（預冷）、氯仿異戊醇（24:1）、液氮、CTAB緩沖液、ITS1、ITS5、Buffer、Taq酶、dNTP、TE

6、緩沖液、DNA電泳膠（0.8g,100ml,5%TBE）、PCR電泳膠（1.0g,100ml，1%TBE）。1.2實驗方法1.2.1菌種的初篩采用的剛果紅染色法對菌株的酶活力進行初步篩選。1211實驗原理：剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅纖維素的復合物便沒法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。1.2.1.2實驗步驟：菌落長滿平皿后，加入適量1.0mg/mL的剛果紅溶液，染色1h后傾去染液，加入適量1.0mol/L的NaCl溶液，洗滌1h。菌體若能分泌纖維素酶，則在菌體周圍會出現(xiàn)清晰的透明圈，根據(jù)透明圈

7、與菌落直徑比值的大小選擇菌株。122菌株的復篩將初篩的11株真菌接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，加一個空白對照管，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)（28，200r/min），分別測定菌株在培養(yǎng)第3d、4d、5d、6d的CMC酶，以酶活力為指標篩選菌株。123纖維素酶活力測定1.2.3.1原理：纖維素酶是一種多組分的酶，其中C1酶的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素；C酶的作用是將無定形纖維素繼續(xù)水解成纖維素寡糖；而0葡萄糖x苷酶的作用是將纖維素寡糖水解成葡萄糖。纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的氨基化合物，利用比色法測定其還原物生成量就可測定纖維素酶的活力。1

8、.2.3.2葡萄糖標準曲線的繪制準確稱取葡萄糖250.0mg，溶于蒸餾水中，定容至250.0mL。分別吸取0.1%標準葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別定容至50.0mL。再分別吸取上述溶液各2.5mL于試管中，各加2.5mL3,5-二硝基水楊酸，煮沸5min（另設1管對照，取2.5mL蒸餾水，加2.5mL3,5-二硝基水楊酸，同樣煮沸5min）。冷卻后，用紫外分光光度計在550nm波長下比色，記錄各管的吸光值，以吸光值作橫座標，對應標準葡萄糖溶液含糖的毫克數(shù)為縱座標，繪制標準曲線。酶活力定義：在上述條件下，每小時釋放1“g葡萄糖的量為一個酶活力單位（U）。葡萄糖含量

9、（mg）0.10.20.30.40.5OD550nm直87654321U3專薔櫃Oy=1.7160 x-0.1302R2=0.99120.0480.2110.3550.5950.724酶液提取將液體發(fā)酵液取出后（包括空白對照），用離心機4500r/min離心10min（去除雜蛋白及一些影響吸光值測定的雜質(zhì)），取上清液則為粗酶液。CMC酶活力測定用CMC酶活力代表內(nèi)切酶活力。在試管中加入1.2mL1.0%濃度的羧甲基纖維素鈉的緩沖液，再加入0.4mL適當稀釋的酶液，于50C恒溫水浴鍋保溫30min，迅速加入DNS試劑2.4mL，沸水中煮5min，冷卻至室溫，加蒸餾水至20.0mL，混合均勻，取上

10、清液在550nm處測定吸光值。1.2.3.5濾紙酶活力（FPA）測定取WhatmanNO.1濾紙一條（1cmx6cm,約50mg），卷成筒狀，投入試管底部,加1.0mLpH值4.6的0.05M醋酸-醋酸鈉緩沖液，再加入適當稀釋的酶液0.4mL，蓋上塞子。將其置于50C恒溫水浴鍋保溫60min。取出試管，迅速加入DNS試劑2.4mL，沸水中煮5min,冷卻至室溫，加蒸餾水至20.0mL，混合均勻。取上清液在550nm處測定吸光值。1.2.3.6-葡萄糖苷酶活力測定在試管中加入1.2mll.O%水楊苷溶液的緩沖液并加入0.4mL適當稀釋的酶液，50C恒溫水浴鍋保溫30min后迅速加入2.4mLDN

11、S試劑，沸水浴5min,冷卻后加水稀釋到20.0mL，在550nm處測定吸光值?？瞻讓φ眨瑢φ諛悠奉A先煮沸滅酶活lOmin,其它同上。1.2.4菌株鑒定1.2.4.1菌落形態(tài)觀察將菌株分別接種到PDA平皿中培養(yǎng)，進行菌落形態(tài)觀察和顯微形態(tài)觀察。1.2.4.2菌株DNA鑒定菌株活化：將菌株接種到蓋有玻璃紙的PDA平皿中，于28C培養(yǎng)34d，待菌絲茂盛而未大量形成抱子時，用已經(jīng)滅菌的藥匙刮去菌絲進行DNA鑒定。DNA提取將已刮好的裝在離心管中的菌絲(裝在2離心管中)加入液氮。將其放入研磨機研磨至均勻。將預熱65C的CTAB緩沖液800ml加入離心管中并且搖勻。將離心管放在65C水浴鍋中水浴30mi

12、n。水浴結(jié)束后加入Tris飽和酚：氯仿異戊醇(25:24:1)等體積混合，12000r5min離心結(jié)束后取上清液加等體積的氯仿異戊醇(24:1)混合，12000r5min離心結(jié)束后取上清液加等體積的氯仿異戊醇(24:1)混合，12000r5min取上清液加滿冰箱預冷(4C)的無水乙醇，放4C冰箱20min。看是否有沉淀，多沉淀的用黃色槍頭挑出放入一個干凈的離心管中。無絮狀沉淀離心10000r10min，然后倒出液體。將冰箱預冷的70%的乙醇加入離心管1ml洗滌DNA。重復第10步(第二遍加時稍微搖一下，充分接觸)把離心管倒立在吸水紙上至管壁沒有水珠，觀察DNA的量。若DNA含量高，加入100u

13、lTE緩沖液，中等加80ulTE緩沖液，少則加入60ulTE緩沖液。再離心2min，放入4C冰箱中。DNA電泳(1)制備凝膠：電泳緩沖液配制的1.0%瓊脂糖用微波爐融化，混勻冷卻至，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳(瓊脂糖的厚度在樣品梳的1/3左右)。取DNA提取產(chǎn)物5.0吐，與2.0吐加樣緩沖液混勻，點樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，以MarkerV(全式金生物技術(shù)公司提供)為分子量標記。5V/cm恒壓電泳,當加樣緩沖液中的溴酚藍遷移至足夠分離DNA片段的距離時,關(guān)閉電源，電泳結(jié)束后將凝膠先在溴化乙錠染色液中染色1015min,然后在凝膠呈像儀上觀察其明暗程度并保存于電腦中。1.2.4.2.

14、3ITS擴增反應及測序利用TransGen公司的2XTaqSuperMix進行擴增反應。以提取的菌株DNA為模板,以ITS1(5-CGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)(WhiteT.J.etal.,1990)為引物，擴增ITS片段,擴增體系如表。PCR反應體系成分體積備注dNTP1吐引物ITS1(10pmol/L)1吐(1OD稀釋至引物ITS4(10pmol/L)1吐500吐)Buffer5吐(1OD稀釋至IaqE1吐500吐)DNA模板5吐ddH20補足至50yLPCR反應條件列表PCR條件溫度時間預變性95C3min變性95

15、C2min退火53C35s延伸72C1min循環(huán)數(shù)34延伸72C10min取PCR擴增產(chǎn)物于1.0%的瓊酯糖凝膠上，以MarkerV為分子量標記。于lxTAE緩沖液中，5V/cm電壓下進行電泳，電泳結(jié)束后將凝膠先在溴化乙錠染色液中染色1015min，觀察其明暗程度并保存于電腦中。PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。2結(jié)果與分析2.1產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選對供試菌株通過剛果紅染色法進行初篩，通過發(fā)酵培養(yǎng)測纖維素酶活力進行復篩，篩選出11真菌株纖維素分解菌，獲得菌種的水解圈直徑與菌落直徑的比值，結(jié)果見表。不同菌株透明圈與菌落直徑菌株編號透明圈直徑菌種編號透明圈直徑/菌種編號透明圈直徑/

16、菌落直徑菌落直徑菌落直徑ACCC325672.57JZG8-32ACCC325721.41ACCC317261.28ACCC325691.83ACCC325711.24五3-3033ACCC324913ACCC325681.31ACCC325661.38ACCC316013.29從此表可以看出真菌ACCC31601的水解圈的直徑與菌落直徑比值最大。然后分別在100mL的纖維素酶活性測定液體培養(yǎng)基中，接種真菌，培養(yǎng)9d。每24h取樣，測得CMC酶活力見下表。初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液CMC酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567723.5951.85973.31023.358

17、16530ACCC31726-142.1680.15715.9980.451116.3301.2五3-303-206.45265.45558.6708.751366.55758.8ACCC32566644.41216.41287.91802.71352.251187.8ACCC32572122.45765.95937.551388744.5701.6ACCC32568-84.9830.31051.95966.15765.95551.45JZG8-3315.5944.71030.5916.1787.4715.9ACCC32569522.851137.751345.11402.31466.6515

18、1.05ACCC32491-199.3901.8966.151430.9451.35201.1ACCC31601201.11852.752081.552260.31609.65994.75ACCC32571551.45465.651266.45951.8537.15537.15在初步確定有降解纖維素能力的11株菌中，菌株ACCC31601、ACCC32566發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CMC酶活力相對較高。其中菌株ACCC31601發(fā)酵液的CMC酶活力最高，為2260.3U/mL,其透明圈與菌落直徑的比值也最大。菌株ACCC32566發(fā)酵液的CMC酶活力稍低，為1802.7U/mL。初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液

19、FPA酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567723.5951.85973.31023.35816530ACCC31726-142.1680.15715.9980.451116.3301.2五3-303-206.45265.45558.6708.751366.55758.8ACCC32566644.41216.41287.91802.71352.251187.8ACCC32572122.45765.95937.551388744.5701.6ACCC32568-84.9830.31051.95966.15765.95551.45JZG8-3315.5944.71030.

20、5916.1787.4715.9ACCC32569522.851137.751345.11402.31466.65151.05ACCC32491-199.3901.8966.151430.9451.35201.1ACCC31601201.11852.752081.552260.31609.65994.75ACCC32571551.45465.651266.45951.8537.15537.15由表可以看出ACCC31601和ACCC31726的FPA酶活較高。初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液卩-葡糖糖苷酶活力（U/ml）菌株4d5d6d7d8d9dACCC32567644.41266.45973.354

21、4.3458.5122.45ACCC31726808.85973.3923.251152.05894.65608.65五3-303294.052746.51223.55908.95901.8251.15ACCC32566322.651216.41087.7858.9344.1251.15ACCC32572751.65951.851123.45908.95773.1472.8ACCC32568901.8994.751001.91287.91159.2544.3JZG8-3172.51037.651202.1858.9687.3415.6ACCC32569251.151273.61581.0511

22、23.45651.55429.9ACCC32491530730.2873.2701.6601.5258.3ACCC316011037.6511021202.1251.15179.65129.6ACCC32571858.9887.526751223.551037.65279.75表中五3-303和ACCC32569的卩嘀糖糖苷酶活較高。面是其折線圖OO初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液CMC酶活力(U/mEACCC32567-ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32569ACCC32491ACCC31601ACCC32571k,W45678

23、9圖1初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液CMC酶活力oooooOooooO505052211oooOooOV5O5匚1一IS5-Rw初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液卩葡糖糖昔酶活力/ml)ooOoOoO21菌株酶活力：ACCC31601的酶活力最高，達2260.3U/m1,其透明圈與菌種直徑的比值也是最大的?？梢钥闯鏊馊εc酶活高低有關(guān)聯(lián)。其次是ACCC32566,其酶活達1802.7U/m1。圖2初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液FPA酶活力ACCC32567ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32E69ACCC32491ACCC31601ACCC32571

24、FPA酶活力：ACCC31726的酶活力最高1731.2U/m1,其次是ACCC31601，其酶活達到1666.85U/m1。圖3初篩菌株液體發(fā)酵粗酶液伕葡糖糖苷酶活力ACCC32567ACCC31726五3-303ACCC32566ACCC32572ACCC32568JZG8-3ACCC32569ACCC32491ACCC31601ACCC32571從圖3可以看出：五3-303的酶活達到2746.5U/ml，其次是ACCC32569酶活達到1581.05U/ml。2.2對酶活測定的11株菌種進行了形態(tài)學鑒定，以下為其鑒定結(jié)果2.2.1菌株ACCC31601（原始編號：141-3）形態(tài)學鑒定在

25、PDA上黑暗培養(yǎng)，28C培養(yǎng)3天菌落直徑85mm,在28C培養(yǎng)48h內(nèi)出現(xiàn)分生抱子。菌落暗綠色，中間為產(chǎn)抱區(qū)，外緣也產(chǎn)抱，菌絲少。PDA上產(chǎn)生黃色的擴散性色素。顯微鏡下分生孢子梗叢束疏松，環(huán)狀排列。分生孢子梗主分枝呈樹狀，其上眾多次級分枝，基部變細、中間膨大、以大角度伸出，終極甁梗長而細。2.2.2菌株ACCC32566（原始編號：遷4-2）形態(tài)學鑒定PDA上菌落呈綠色，絮狀，生長迅速，一般25C下3天基本可以鋪滿平板，木霉菌落開始時為白色，致密，圓形，向四周擴展，后從菌落中央產(chǎn)生綠色抱子，中央變成綠色。菌落周圍有白色菌絲的生長帶。在顯微鏡下可以看到其抱子呈爪狀,分生孢子梗主分枝呈樹狀，其上眾

26、多次級分枝、以大角度伸出，終極甁梗長而細。2.2.3菌株ACCC31572（原始編號：三5-10）、菌株ACCC32569（原始編號：三4-4）形態(tài)學鑒定菌落特征：該菌生長緩慢，菌落呈放射狀向外延生，菌絲初為白色，后期抱子呈綠色；形態(tài)特征：菌絲體產(chǎn)生大量的分生抱子梗。分生抱子梗頂端膨大成為頂囊,一般呈球形。項囊表面長滿一層或兩層輻射狀小梗（初生小梗與次生小梗）。最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生抱子。2.2.4菌株五3-303形態(tài)學鑒定菌落特征：該菌生長非常緩慢，菌落呈放射狀向外延生，菌絲初為白色，后期抱子呈綠色。形態(tài)特征：基部無足細胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生抱子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生

27、幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體。2.2.5菌株ACCC32491（原始編號：JZG12-1）形態(tài)學鑒定菌落特征：該菌生長迅速，呈不定型棉絮狀或致密叢束狀，其表面的顏色多呈綠色。菌絲有隔分枝，厚垣抱子有或無。分生抱子梗是菌絲的短側(cè)枝，側(cè)枝上對稱或互生分枝，形成二級和三級分枝，分枝角度為銳角或近于直角，在分枝末端形成瓶狀小梗。分生抱子多為卵圓形，無色或綠色，簇生于小梗頂端。2.2.6菌株ACCC32568（原始編號：JZG7-1）、菌株JZG8-3形態(tài)學鑒定菌落特征：該菌生長較快，菌落呈放射狀向外延生，菌絲各細胞之間有橫隔膜，菌絲初為白色，后期抱子呈綠色。形態(tài)特征：基部無足細胞，頂端

28、不形成膨大的頂1囊，其分生抱子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚。JZG7-I2.2.7菌株ACCC32567（原始編號：四6-5）形態(tài)學鑒定菌落特征：該菌落生長較快，呈絲絨狀至絮狀，致密，其表面顏色呈灰綠色。分生抱子頭球形至輻射形，一般直徑為52-125“m，小分生抱子頭似青霉狀，呈疏松柱形或散亂；分生抱子梗直接生于基質(zhì)或生于氣生菌絲，壁較厚，光滑，頂囊較小，近球形或稍呈橢圓形，分生抱子為球形或近球形，壁明顯粗糙，具小刺。2.311株菌種的rDNA-ITS序列分析2.3.1為確定11株菌株在分類學地位，對其進行了ITS基因序列測定，所獲的ITS基因序列長度在60Obp左右，

29、然后在NCBI中進行比對。2.3.2以下為11株菌種的ITS序列2321菌株ACCC31601的DNA-ITS區(qū)序列：CGCTTCGAATTTACACTCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATG

30、AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTC

31、GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAAGAA通過比對確定其為Trichodermaharzianum（哈茨木霉）2322菌株ACCC32566的DNA-ITS區(qū)序列：TACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTC

32、GGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGC

33、ACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT通過比對確定其為Trichodermacitrinoviride（桔綠木霉）2323菌株ACCC32569的DNA-ITS區(qū)序列：ACCGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGAGTAATGCAGTC

34、TGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGGGGGGGGACGGACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCAC

35、CCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGC通過比對確定其為Aspergillusaureolatus（具黃曲霉）232.4菌株ACCC32491的DNA-ITS區(qū)序列：AGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA

36、TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGTCCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCT通過比對確定其為T

37、richodermaviride（綠色木霉）2.3.2.5菌株ACCC32572的DNA-ITS區(qū)序列：AGCGCCCCTCGGGGAGCGAGCCGCCGGGGACCACCGAACTTCATGCCTGAGAGTAATGCAGTCTGAGCCTGAATAGTATAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT

38、GCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCTCCGGGGGGGGGACGGACCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGGCGTCTCCAACCATTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC通過比對確定其為Aspergillusaureolatus（具黃曲霉）2.3.2.6菌株ACCC32571的DNA-ITS區(qū)序列：CGCCCAACCTCCCACCCGTGACTACCTAAC

39、ACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCCCCCCAGGGGCGAGCCGCCGGGGACCACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGCCTGAATACAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGGCGTCTCCAACCTTATTTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC通過比對確

40、定其為Aspergillusnidulans（構(gòu)巢曲霉）2327菌株ACCC31726的DNA-ITS區(qū)序列：GGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCCCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGC

41、TGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG通過比對確定其為Trichodermaovalisporum（卵抱木霉）2328菌株ACCC32568的DNA-ITS區(qū)序列：GGGGACGCACGTCTCC

42、GGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTGTGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACG

43、TCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCATGTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC通過比對確定其為Penicilliumpinophilum（嗜松青霉）2329菌株ACCC32567的DNA-ITS區(qū)序列：GCCACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGAT

44、GCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACC

45、TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA通過比對確定其為Aspergillussydowii（聚多曲霉）23210菌株五3-303的DNA-ITS區(qū)序列：ATGGTTGGAGACGCCGGCTGGCGCCCGGCCGGCcCTAGTCGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACACGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGTCCGTCCCCCCCCCGGAGGGGGGGAACGACAACCCAACACACAAGCCGGGTTTTTATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAGTTCG