放射免疫技術(shù)

1、第六章 放射免疫技術(shù)(jsh)第一節(jié)放射免疫技術(shù) 一、原理及分類 二、常用的放射性核素 三、標(biāo)記物制備(zhbi)及鑒定 四、抗血清鑒定共四十一頁第二節(jié)放射免疫分析 一、基本原理 二、實驗方法(fngf)及測定第三節(jié) 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA與RIA的比較思考題小結(jié)(xioji)共四十一頁免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行檢測(jin c)。標(biāo)記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。標(biāo)記免疫分析：用可微量或超微量檢測的示蹤劑標(biāo)記抗原、抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。標(biāo)記(bioj)免疫技術(shù)基本概念共四十一頁常見標(biāo)記(bioj)免疫技

2、術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫(miny)技術(shù)熒光免疫技術(shù) 共四十一頁第一節(jié) 放射免疫技術(shù)(jsh)共四十一頁早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑(shj)用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大地推動作用。 共四十一頁放射免疫RIA以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭(jngzhng)結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。 免疫放射IRMA以過量標(biāo)記抗體

3、與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離(fnl)游離和結(jié)合標(biāo)記抗體。放射受體分析RRA放射配體結(jié)合分析RBA其它一、放射免疫技術(shù)原理及分類共四十一頁二、放射免疫技術(shù)(jsh)常用的放射性核素 放射性核素是指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N放射性核素，并同時釋放射線，放射性核素的這一轉(zhuǎn)變過程(guchng)稱為放射性衰變。依衰變方式不同分為、三類。共四十一頁二、放射免疫技術(shù)(jsh)常用的放射性核素 125I 3H 射線 理化性 活潑 差核素豐度 90% 半衰期 60.2d 12.3y標(biāo)記(bioj)方法 簡單 復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備 低廉 昂貴測量條件 簡單 復(fù)雜常用標(biāo)記

4、核素共四十一頁125碘-標(biāo)記(bioj)物的制備標(biāo)記(bioj)125I-化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負(fù)電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記(bioj)物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。 125I或125I+125I-標(biāo)記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應(yīng)直接標(biāo)記法三、放射免疫技術(shù)標(biāo)記物制備及鑒定共四十一頁使用無還原劑的高比放射性碘源被標(biāo)記物用量要少ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積(tj)200l反應(yīng)時間1-2分鐘弱堿性反應(yīng)條件 （7.4-7.6）共四十一頁間接(jin ji)標(biāo)記法聯(lián)接標(biāo)記(bioj)( bolton-Hunter )預(yù)先將125I用ch-T

5、法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基團(tuán)可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。 bolton-Hunter共四十一頁125碘-標(biāo)記(bioj)物的制備純化凝膠過濾法離子交換層析(cn x)法 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜法 聚合、損傷物 標(biāo)記蛋白游離125I共四十一頁125碘-標(biāo)記(bioj)物的制備鑒定 標(biāo)記物質(zhì)量高比(o b)放射性高純度完整免疫活性 放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率應(yīng)大于95% 免疫活性標(biāo)記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比該值越大, 標(biāo)記物免疫活性好（應(yīng)大于80%） 共四十一頁比放射(fngsh

6、)活性單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度。每分子抗原平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目。單位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性過高，將影響標(biāo)記物免疫活性 計算(j sun)法：依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來計算標(biāo)記物的比放射性.自身置換法 ：比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測定標(biāo)記物的比放射性 結(jié)果準(zhǔn)，測定復(fù)雜共四十一頁比放射性計算(j sun)法 結(jié)果欠準(zhǔn)，計算(j sun)簡便共四十一頁 自身置換曲線 反應(yīng)系統(tǒng)：限量Ab和遞增劑量(jling)(cpm)的標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)記抗原總量的增加而減少 標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)曲線 反應(yīng)系統(tǒng):抗體（限量）、標(biāo)

7、記抗原（定量）和劑量遞增的標(biāo)準(zhǔn)品抗原組成 標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)準(zhǔn)抗原的增加而競爭抑制性減少 通過比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)品抗原的免疫活性來測定標(biāo)記物的比放射活性。共四十一頁比放射性自身(zshn)置換法 標(biāo)準(zhǔn)曲線(qxin)與自身置換曲線(qxin)平行表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實驗中抗體上結(jié)合 的抗原物質(zhì)總量相同計算置換曲線平行段某結(jié)合率的放射性強(qiáng)度(cpm/ml換算 為nCi/ml) 計算標(biāo)準(zhǔn)曲線平行段相應(yīng)結(jié)合率對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗原化學(xué)量 (ng/ml)以平行段多點結(jié)合率對應(yīng)的放射強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)抗原量進(jìn)行直 線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng)共四十一頁125碘-標(biāo)記物的制備

8、(zhbi)鑒定 標(biāo)記物質(zhì)量高比(o b)放射性高純度完整免疫活性 共四十一頁四、放射免疫技術(shù)(jsh)抗血清鑒定 抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的結(jié)合強(qiáng)度用親和常數(shù)Ka表示(biosh)。單位為稀度單位（LM-1）Ka值高（10912L/mol）有助于提高靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度 親和性親合力高親合力低共四十一頁放射免疫技術(shù)(jsh)抗血清鑒定特異性:指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力交叉反應(yīng)率：將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降50% 時特異性抗原與類似物的劑量（ED50）之比抗體交叉反應(yīng)程度直接(zhji)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性 特異性效價共四十一頁五、方法學(xué)評價(pngji)除了

9、常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應(yīng)注意(zh y)以下指標(biāo)：可靠性劑量-反應(yīng)曲線高劑量鉤狀效應(yīng)共四十一頁第二節(jié) 放射免疫分析(fnx)共四十一頁放射免疫分析RIA以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合特異性抗體(kngt)來測定待檢樣品中抗原量。 共四十一頁一、放射免疫分析(fnx)基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)(fnyng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力共四十一頁Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量

10、降低(jingd),二者變化成函數(shù)關(guān)系。 共四十一頁以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(BF)與Ag的量變存在(cnzi)著函數(shù)關(guān)系劑量反應(yīng)曲線 注：T即是B與F的總和(zngh)共四十一頁二、放射免疫分析實驗方法(fngf)及測定抗原抗體(kngt)反應(yīng)Ag*Ag反應(yīng)條件體積溫度時間pHAb(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)平衡非平衡一步法二步法 實驗過程包括：抗原抗體反應(yīng)、分離結(jié)合標(biāo)記物、放射性測定和數(shù)據(jù)處理等。共四十一頁分離結(jié)合(jih)、游離標(biāo)記物二抗體(kngt)沉淀法 PEG 沉淀法 PR 試劑法 活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)

11、影響 操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì) 只有將B和F分離，并測定其中一個組分（一般測量結(jié)合標(biāo)記物），才能得到劑量反應(yīng)曲線。共四十一頁測量(cling)、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計數(shù)器 包括了NaI閃爍晶 體、光電倍增(bi zn)管 以及計數(shù)器測量的放射性信 號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)(cpm) 計算 參數(shù)cpmB/T (%)F/T (%)B/F (%)B/B0 (%)擬合注：T即是B與F的總和 定量的依據(jù)是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品抗原與測量的結(jié)合標(biāo)記物的放射強(qiáng)度之間的函數(shù)關(guān)系。共四十一頁第三節(jié)(snji) 免疫放射分析共四十一頁一、免疫放射分析(fnx)基本原理以過量125I標(biāo)記抗體與待測抗原(kng

12、yun)進(jìn)行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng), 用固相免疫吸附劑對B或F進(jìn)行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。 共四十一頁單位(dnwi)點 IRMA先用過量標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行(jnxng)反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離, 測定上清液的放射量 共四十一頁雙位點 IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過量的標(biāo)記(bioj)抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測固相上放射性。 共四十一頁 與放射免疫分析不同(b tn)，免疫放射分析采用固相吸附分離方法。免疫放射技術(shù)一般以塑料（聚苯乙烯）試管作為反應(yīng)容器和固

13、相吸附材料。聚苯乙烯能夠吸附蛋白質(zhì)（抗原或抗體）并保留原有結(jié)合抗原特性。當(dāng)吸附特異性抗體與抗原發(fā)生反應(yīng)時于固相材料表面形成復(fù)合物，未結(jié)合物質(zhì)存在于液相中，將反應(yīng)液棄掉并洗滌即可達(dá)到分離目的。具有操作簡便、省時、無需離心步驟等優(yōu)點。分離結(jié)合、游離(yul)標(biāo)記物共四十一頁對于雙抗體夾心法，用已知濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品抗原進(jìn)行反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合部分（B）放射性計數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得正向劑量(jling)反應(yīng)曲線。測量(cling)、數(shù)據(jù)處理共四十一頁二、IRMA與RIA比較(bjio)共四十一頁放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好, 常用于各種激素(j s)、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物

14、和藥物等微量物質(zhì)的測定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足, RIA將逐漸被取代。放射免疫分析技術(shù)(jsh)的應(yīng)用共四十一頁1.放射免疫技術(shù)的核心是什么？2.制備放射性125I標(biāo)記物的基本原理是什么？有哪些方法？3.評價125I標(biāo)記物質(zhì)量的指標(biāo)有哪些？4.用于放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)滿足哪些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)？5.放免分析中標(biāo)記/未標(biāo)記抗原、抗體的用量特點及與免疫復(fù)合物的量變關(guān)系？6.反應(yīng)結(jié)束后，如何將免疫復(fù)合物與游離標(biāo)記物分離開？7.放射免疫分析實驗中，如何確定待測抗原的含量？8.免疫放射分析與放射免疫分析的反應(yīng)原理有何不同？9.閃爍計數(shù)器記錄的信號即是放射核素的衰變(sh

15、uibin)嗎？10.靈敏度、特異性和測定范圍，免疫放射分析與放射免疫分析有何區(qū)別？思考題共四十一頁放射免疫技術(shù)的基本原理是放射性核素可探測的靈敏性、精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，主要包括RIA和IRMA。RIA所用(su yn)的標(biāo)記物應(yīng)具備高比活度、高純度和完整的免疫活性；抗血清應(yīng)具有較高的抗體親和力、高度的特異性和適宜的工作滴度；標(biāo)準(zhǔn)品濃度需按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定；結(jié)合與游離反應(yīng)物的分離（二抗法、PEG法、PR試劑法和固相法）應(yīng)徹底、迅速、不影響反應(yīng)平衡、非特異性低和操作簡便。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線需根據(jù)不同檢測項目和不同的要求選用恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)參數(shù)。小 結(jié)共四十一頁內(nèi)容摘要第六章 放射免疫技術(shù)。化成碘原子或正電碘。125I或125I+。標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線平行。表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實驗中抗體上結(jié)合。單位為稀度單位（L