酵母雙雜共轉(zhuǎn)

1、酵母雙雜交的原理及實驗步驟吳健 2015.12.25一酵母雙雜交的原理在酵母細胞中，有半乳糖存在的情況下，GAL4可以激活半乳糖代謝酶GAL1的轉(zhuǎn)錄。GAL4蛋白包含兩個結(jié)構(gòu)域，單獨的 N端的結(jié)構(gòu)域（BD）可以特異地結(jié)合 DNA但是不能夠激活轉(zhuǎn)錄；單獨的 C端包含一個激活區(qū)域（AD）但是如果不能結(jié) 合到17-mer上游激活序列 USA G也不能激活轉(zhuǎn)錄。將來自大腸桿菌的LecA DNA結(jié)合域 BD和酵母的 GAL4轉(zhuǎn)錄激活域 AD重組后，在酵母中實現(xiàn)了下游基因的轉(zhuǎn) 錄激活。說明轉(zhuǎn)錄因子的BD和AD功能域可相互獨立地發(fā)揮各自的作用，并且在重組后仍然具有基因轉(zhuǎn)錄的活性（Brent and Ptas

2、hne, 1985）。酵母雙雜交系統(tǒng)就是在這一分子基礎(chǔ)上開發(fā)出來的，GAL4的BD和AD,分別與能夠互作的蛋白X和Y融合表達。由于 XY蛋白的結(jié)合，實現(xiàn)了 GAL4的BD和AD重組，GAL4就重新 獲得了轉(zhuǎn)錄活性，轉(zhuǎn)錄因子就可以驅(qū)動報告基因表達（Fields and Song, 1989）。除了將兩個雜合載體 BD-X或AD-Y轉(zhuǎn)化入同一酵母細胞外，利用兩個不同性別的酵母 雜交（mating）也是實現(xiàn) BD和AD蛋白重組和蛋白互作檢測的有效方法（Bendixen etal., 1994）。IV:兩個蛋白分別融合AD、BD,但它們 之間沒有物理接 觸。（蛋白 A-GAL4BD, 蛋白 B-GAL

3、4AD, 之聞無互作）V：兩個蛋白分別融合 AD、BD,且它們 之間有物理接觸口（蛋白A-GAL4BD, 蛋白 B-GAL4AD, A, B之間有互 作）Fig1.酵母雙雜原理圖A, GenotypesTABLE I. MATCHMAKERYEAST STRAIN GENOTYPESStrainGenotypeReferencesAH 109MA7at trp1-9O1t ieu2-3t 112, ura3-52t his3-200t gaWA, galdO LYS2 ：; GAL 1- GAL 1 TAn-HiS3.GAL2GAL2t-ADE2,URA3 : MEL 1MEL1TAlacZ.

4、 MEL TJames et aLf 1996： Our Linpublished observationsY187MATu, uraS-52, his3-200t ade2-Wt trpl 90lrleu2-3r 112.。日必 mer. gWBQkUPA3: G4L 兀幅-G4L*歸gZ, MEL tHarper et al.f 1993 The GAL 1, GAL2. and MEL1 upstream activating sequences (UASs) are responsive to rhe GAL4 transcriptional acrivator. Th& trp1r

5、hi$3r 白剖4、and gai80 mutations are all deletions； Ieu2-3r a double mutation.b AH 109 is a derivative of strain PJ69-2A and includes the ADE2 and HJS3 nuirigrial markers and an endoflenous MEL1 gene (James etal., 199S), The facZreporter gene was introduced into PJ69-2A to create strain AH 109.Fig2,常用兩

6、種酵母菌的基因型AH109 ConstructsGAU UASGAL1 TATAHIS3GAL2 UASGAL2TATAA阻MEL1 UASMELI TATAIacZMELI UASME” TATAMELIY187 ConstructsGALI UASGALI TATAIacZFigure 5. Reporter gene constructs in yeast strains AH 109 and 187. Strain A HI 09 is a derivative of strain PJ69-2Aand includes the ADE?and HIS3 nutritional mar

7、kers (James et aLr 1996), MEL 1 is an endogenous GAL4-responsive gene. The iacZreporter gene was introduced into PJ69-2A to create strain AH 109. The HIS3. ADE2, and MEL 1/lacZ reporter genes are under the control of three completely heterologous GAL4-responsive UAS and pmmotw 印日rnntsGAL1. GAL2, and

8、 MEL1P respectively.Fig3.常用兩種酵母菌的報告基因TJtPlInatEwe aiActiwerlhjucpGADT78.0 kbC“n耽met 9 DNA-BD FusionSection VlliSelect lor diploids expressing iniefacling proleins.Fig4,常用AD和BD載體圖AneW$i 卑Verily positive劑時盟而佰Analtti*Verjfij! iposiliwe interactionsFig5.酵母雙雜流程圖Generate a cDNA LibrarySection 俄口0(旭 bail g

9、ene into pGBKT7 or other Matchmaker GAI4b百輪d DNA-BO vector1Q0 叫加 t口閭 RNA o 25 ng 5 poly Af RNASynthes lzb tinsttrand cDNA.Amplify sfccDNAfcy LD-PCR.Translomn AHI 09 and Y187 with teit plasmid. Test hr autonomiDus reporter gene activation and cell loxicily.Puriiy (:size浦昌曲# cDNA.SeeTrouNeshooiing Mig

10、.Prepare ccumpatant AHI 09 片打趾 collt AppendiK BLibrary Construclion (Three-StepCglTanslorm 丫航就 striain AH109 with: ds cDNA* pGADT7-FtecLibrary ConstFiiclicin One-Step)Cotrartsform yeast sllrtin AH 109 with:cfc cDNA pGADT7-R&c DNABO/bait pt9smidProtocol A Construct an AD Fusion Libiranr* Screen by Ve

11、ast MatingSection XIIProtocol BConstruct am AD Fusion Ubrary Screen by Colrainsforination(S 凱加 n KIIJTwo-Hybrid ScreeningSelect fm transformants expressing interading protein 隊Two-Hybrid ScreeningMale with Y187 pretransfonned . with DNA-GO/bait plasmid.Hnd III 116061AD載體HifU III |t01Prepare Y18? cel

12、ls tqr mating.Select translofinanis on SDMeuHarvest iFoall Transformanls.H加d III 46S44Hind III (22801HinA II 畫pGBKT77.3 kbPrapar 藤 eampatent cellsAppendix BHD載體二酵母雙雜交的基本步驟1酵母感受態(tài)的制備配制培養(yǎng)酵母 YPAD培養(yǎng)基, 以及篩選和轉(zhuǎn)化酵母的SD培養(yǎng)基, 滅菌備用。1）用滅菌的接種環(huán)從保存的菌種中挑取一小塊，在 YPAD培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，在30c培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d活化菌種；2）用滅菌的接種環(huán)挑取一個2-3 mm,生長

13、時間小于一個月的單克隆到3 ml的YPAD培養(yǎng)基中，劇烈震蕩1 min,打散所有的細胞塊，30c震蕩培養(yǎng) 8 h;接種5科的培養(yǎng)物到含有50 ml YPAD 的250 ml的燒瓶中，30 C , 250 r/min震蕩培養(yǎng) 20 h,直到 OD 600 =0.3;700 g室溫離心 5 min,去除上清，用 100 ml的 YPAD 重懸細胞塊，30 C 230-250 r/min 震蕩培養(yǎng) 3-5 h,直到 OD 600 =0.4-0.5 ;700 g室溫離心 5 min,去除上清，用 60 ml的滅菌的dd H2O重懸細胞塊；700 g 室溫離心5 min,去除上清，用 3 ml的1.1

14、TE/LiAc溶液重懸細胞塊；7）將上清分裝到 2個無菌的1.5 ml的離心管，室溫 13200 g離心15 sec；8）去除上清，用 600 l 1.1 XTE/LiA液懸浮細胞塊，感受態(tài)制備完成。制好的感受態(tài)細胞應該立即使用（2 h以內(nèi)），不能長時間保存。2酵母小規(guī)模轉(zhuǎn)化2）在預冷無菌的1.5 ml的離心管中依次加入：質(zhì)粒 DNA0.5 /herring testes carrier DNA （10mg/ml）5 l（使用前沸水煮 5min ,立刻放入冰上）感受態(tài)細胞50科l輕輕震蕩混勻；3）加入0.5 ml的PEG/LiAc溶液，輕輕在振蕩器上震蕩混勻；4）在30c水浴中孵育 30 mi

15、n,每隔10 min混勻一次；加入 20 科的 DMSO （ Dimethyl sulfoxide ）, 42 c水浴熱休克 15 min ,每隔 5 min 混勻一次；6）最高轉(zhuǎn)速離心15 sec,去除上清，用1 ml YPD plus液體培養(yǎng)基懸浮細胞塊；30 c震蕩培養(yǎng) 90 min；8）最高轉(zhuǎn)速離心 15 sec,去除上清，用 1 ml的0.9%的NaCl溶液懸?。?）取1:10, 1:100, 1:1000的稀釋度涂皿；或者直接取100 d涂于相應的SD平板上，10） 30 c倒置培養(yǎng)直到單克隆長出，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化效率。挑取單克隆檢測以及保存菌種， 備用。PS:-PEG/LiAc solu

16、tion polyethylene glycolyiithium acetate)Prepare fresh just pt tor to use.Final Cone, Io prepare 10 ml of solutionPEG 400040%8 ml of50% PEGTE butterIX1 ml of10XTELiAc1X1 ml of10X UAc Stock solutions5(1% PEG 3350 (Polyethylene glycclr avg. mol. wt. = 3t350; Sigma Cat No. P-3640) prepare with sterile

17、deionized H?O; if necsssary, warm solLlion to 50SC to help the PEG go into Solution.100% DMSO (Dimethyl sulfoxide： Sigma Cat No, D-8779)10XTE buffer: 0.1 M Tris-HCL 10 mM EDTA, pH 7,5 Autoclave.10X LI Ac: 1 M lilhium acelale (Sigma Cat No, L-6883) Adjust io pH 7.5 with dilute acetic acid and aulodav

18、e.XTE/LiAc (10ml) TOC o 1-5 h z 10XTE：1.1ml10XLiAc：1.1mlH20：7.8ml3誘餌蛋白的細胞毒與自激活檢測細胞毒檢測：比較含有誘餌載體的酵母菌株(BD-Bait )和BD (pGBKT7 )空載體的酵母菌株在 YPAD培養(yǎng)基中的生長速率，如果前者的生長速率明顯緩慢，則該蛋白可能有 毒。自激活檢測：將含有誘餌載體的酵母菌株(AH109)在4 ml SD/-Trp培養(yǎng)基中活化 8h,最高速離心 15 sec,去掉上清；用 1 ml的0.9%的NaCl溶液懸浮，各取 100科懸浮 液涂布于 SD/-Trp , SD/-His/-Trp 和SD/-

19、Ade/-Trp 培養(yǎng)基中篩選。30c倒置培養(yǎng) 3-5 d, 根據(jù)菌斑的生長情況判斷誘餌蛋白是否具有自激活活性。如果有誘餌載體的菌株在SD/-Trp能夠生長但在 SD/-His/-Trp與SD/-Ade/-Trp培養(yǎng)基上都不能生長表明其沒有自激活，如果在SD/-His/-Trp或SD/-Ade/-Trp任何一個培養(yǎng)基上能夠生長則表明其有自激活。假如有自激活，這時可以使用適量的 HIS3蛋白競爭性抑制劑 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole )以降低 背景；或者再增加一種更加嚴格的報告基因的篩選如Ade(Ade和His同時缺)。PS: 3-AT濃度確定：Plate yeast

20、 transforrrams on a series of SD/-His/-Trp plates containing ditferent concentrations oi 3-ATIf you are working with AH109 transformants containing DNA-BD plEismids such as pGBKTZ, we recommend you start by testing 3-AT in the range 0 to 15 mM (e.g, 0, 2.5, 5 75, 10, 125. and 15 mM).If you are worki

21、ng with Y187 transformants containing pHIS2 reporter plasmids, we recommend you start by lesting 3-AT in the range 10 to 60 mM.Note: These are recommendations only. The optimal concentralion may be slightly higher or lower depending on the ccnstrud and strain used.Use the lowest concentration of 3-A

22、T that, after one week, allows only small (1X10個/ml。至此酵母誘餌載體的構(gòu)建和檢測已經(jīng)完成，可以用于后續(xù)實驗分析。4點對點酵母雙雜1)將待驗證的兩個蛋白分別構(gòu)建至BD及AD載體；a)將蛋白-BD和蛋白-AD載體分別轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109和Y187 ,進行點對點的 mating ;b)將蛋白-BD和蛋白-AD載體同時共轉(zhuǎn)入同一個酵母菌(AH109或Y187)?；蛘咿D(zhuǎn)入蛋白-BD蛋白的酵母菌作為感受態(tài)，再分別轉(zhuǎn)入各種蛋白-AD。對照的設(shè)置：TABLE XII. CONTROL TWO-HYBRID COTFtANSFORMATlONS: EXPEC

23、TED RESULTSControl StrainPlate on SO Minimal MediaPhenotypeMell His/AdePositive Control AHlO9pGADT7-RecT + pGBKT7 53)-is/-Leu/-Trpai-GalBins*Negative Control AHi D9(pGADT7-RecT + pGBKT7-Lam|-Adef-His/-Lbu/-Trp/X4i-Galno colonies 2)在缺素培養(yǎng)基(SD/ -His/ 七eu/ 口rp or SD/ *de/ -His/ -Leu/ 干rp)上篩選。X-Gal顯色檢測(1

24、)配制 Z buffer/X-Gal 緩沖液；(2)準備一張直徑為9 cm的定性濾紙，先用 2 ml的Z buffer/X-Gal緩沖液浸透;(3)用鐐子將另一張干凈的濾紙緊貼培養(yǎng)基表面，并用手指輕輕按壓，使菌落緊貼濾紙。在濾紙上做好標記確定濾紙上菌落和平皿上菌落的對應關(guān)系；(4)用鐐子小心將濾紙取下，使有菌面朝上，將其轉(zhuǎn)移到液氮中速凍10 -30sec;(5)將濾紙取出，室溫凍融，轉(zhuǎn)移到用Z buffer/X-Gal緩沖液浸透的濾紙上，避免產(chǎn)生氣泡；(6)在30 c孵育染色，每隔半個小時觀察一次染色結(jié)果；(7)根據(jù)染色結(jié)果挑出陽性克隆，并保存菌種備用。Z buffer:Na2HPO48.52 gNaH2PO44.8 gKCl0.75 gMgSO4add ddH2O to 1L0.12 g調(diào)節(jié)PH值至7.0,過濾滅菌。X-gal 20mg/ml 溶解于 DMSO 或者 DMF 中Z buffer/X-gal溶液： 【現(xiàn)配現(xiàn)用】 TOC o 1-5 h z X-gal （20mg/ml ）20L伊疏基乙醇12LZ buffer2 ml5培養(yǎng)基配制氨基酸粉末（溶液：1.35g/L）Alanine,Arginine,AspaticAcid ,Asparagine,Cysteine,GlutamicAci