楊樹EBP1基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

1、楊樹 EBP1 基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建收稿日期： 2014-05-25 基金項目：天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金 （編號： 20120619 ） ; 天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（編號： 14JCQNJC1500 ） 0 。通信作者： 閻國榮，博士，教授，主要從事植物資源學(xué)研究。 E-mail ： yanguorongeyou 。自然界中植物種類繁多、 形態(tài)各異， 其中器官大小是造成植 物形 態(tài)多樣性的主要因素之一。 不同植物間器官大小可能存在顯 著差異， 但 就同一物種內(nèi)相同基因型的不同植物個體而言， 在相 同的生長環(huán)境下它 們的器官大小基本一致， 表明植物各器官最終 大小的形成受到嚴(yán)格的

2、遺 傳調(diào)控 1 。因此，近年來從不同植物 中挖掘參與器官大小發(fā)育調(diào)控的 基因或轉(zhuǎn)錄因子并揭示其調(diào)控 機制的研究備受關(guān)注， 并已在擬南芥和一 些農(nóng)作物如水稻、 玉米、 油菜、番茄、馬鈴薯等中取得了長足的研究進 展 1-2 。有研究 發(fā)現(xiàn)，在外界生長條件一致的情況下， 植物各器官的 最終大小在 細(xì)胞水平上受細(xì)胞數(shù)量和大小的協(xié)同控制 3 。因此， 分離、 克 隆參與調(diào)控植物細(xì)胞數(shù)量和大小的基因并闡釋其功能是揭示植 物器官 大小發(fā)育控制機制的關(guān)鍵。 目前， 在擬南芥等草本植物中 已有多個相 關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被成功分離和克隆。有研究表明，AINTEGUMEN（ TAANT ）4 、ANGUSTIFO

3、LIA （3 AN3 ）5 、GROWTH-REGULATING FACT （OARtG5 RF5 ） 5 、 GRF-INTERACTING FACTO （R GIF ） 6-7 、JAGGE （DJAG ）8 、STRUWWELPE （ T ESRWP ） 9 、SWELLMAP （1SMP1 ）10 、KLUH （KLU ）11 、EBP112 及Auxin-Regulated Geneinvolved in Organ Size（ ARGO ） S13-14等主要通過正向調(diào)控細(xì)胞增殖能力控制器官內(nèi)細(xì)胞數(shù)量， 進而影 響器官 大小。 這些基因的異位過表達(dá)可通過延長細(xì)胞增殖時間導(dǎo) 致植物器

4、官變 大，而突變則會導(dǎo)致植株器官整體變小。另外，還 有一些基因通過調(diào)控 細(xì)胞大小來影響器官的大小， 如 ARGOS-LIKE （ARL ）15 、 ROTUNDIFOLIA （3 ROT3 ）16 、AtGRF1/217 、 BIGPETAL18 、 AtTOR19 、ORGANSIZE RELATED （1 OSR1 ）20 等，其中擬南芥中 EBP1 被證實對植物細(xì)胞數(shù)量和大小均能發(fā)揮 正向調(diào)控作用 12 。擬南芥 EBP1 是和人類的 ErbB-3 表皮生長因 子受體結(jié)合蛋白同源的一個基因， 與核糖體的生物合成相關(guān)， 該 基因在進化上具有較高的保守性。 目前 除在擬南芥外， 在沙冬青 和

5、馬鈴薯中也有該基因序列的相關(guān)報道， 但 該基因在其他植物中 的功能仍未知， 特別是在木本植物中， 尚未有該 基因的相關(guān)報道。 因此，本研究對楊樹中 EBP1 基因進行克隆，并對其 表達(dá)載體進 行構(gòu)建。相關(guān)研究對進一步揭示楊樹 EBP1 的功能具有重要 意義， 同時對采用基因工程等手段提高林木產(chǎn)量和品質(zhì)具有潛在的應(yīng) 用 價值。1 材料與方法試驗材料黑楊（ Populus nigra ），種植于南開大學(xué)校園內(nèi) ;pEASY-T1 載體，購于北京全式金生物技術(shù)XX 公司；植物表達(dá)載體 PBI121 、 農(nóng)桿菌 LBA4404, 均由筆者所在實驗室保存。方法黑楊總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 采用改良的 C

6、TABt 提取黑 楊葉片 總 RNA 以 Oligo dT （ 18 ）為逆轉(zhuǎn)錄引物，在 M-MLV 作 用下逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 。引物設(shè)計及同源克隆 以擬南芥及其他草本植物中已 經(jīng)報道 的 EBP1 基因 DNA 及 cDNA 序列為種子序列， 利用 Blast 序 列比對軟件 搜索楊樹基因組及 EST 數(shù)據(jù)庫，獲得楊樹中候選 EBP1 基因序列。隨后 根據(jù)篩選、獲得的楊樹中 EBP1 候選序列設(shè)計引 物，進行擴增，并對擴增結(jié)果進行測序驗證。進一步對 NCBI 數(shù) 據(jù)庫中 收集的楊樹 EBP1 相關(guān) EST 序列進行分析，結(jié)合測序結(jié)果， 對楊樹中 EBP1 基因全長 cDNA 序列進行克隆及

7、序列分析。楊樹 EBP1 表達(dá)載體構(gòu)建及分子鑒定 根據(jù)已獲得的 楊樹 EBP1 候選基因全長 cDNA 序列，設(shè)計帶有酶切位點的全長 cDNA 擴增 引物，對 EBP1 全長 cDNA 進行擴增及 T-A 克隆。挑取 含有楊樹 EBP1 全長 cDNA 的陽性克隆，放大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通 過雙酶切獲得帶有黏 性末端的 EBP1 全長 cDNA 序列。進而與經(jīng)過 相同雙酶切的植物表達(dá)載 體 PBI121 采用 T4 連接酶進行連接， 最 終獲得 EBP1 重組表達(dá)載體。 將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞，在 LB+ 卡那霉素（ Kan ）板上篩 選陽性克隆進行菌液 PCR 和 酶切驗證， 進而

8、獲得插入方向和序列完全 正確的陽性克隆。 隨后并采用凍將該陽性克隆放大培養(yǎng)， 采用質(zhì)粒提取試劑提取重組質(zhì)粒， 融法將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌 LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞，在 YEB+ 鏈霉素（ str ） +利福平（ Rif ）板上篩選陽性克隆進行菌液 PCR 驗證。 2 結(jié)果與分析楊樹 EBP1 基因的克隆根據(jù)序列同源性分析結(jié)果，設(shè)計引物對 EBP1-1F ：5 -ATGTCGTCAGACGACGA G 和 EBP1-1R :5 -TTCCTAGACGGCGGTGG- 以黑楊 cDNA 為模板對楊樹中 EBP1 候 選基因進行克隆。擴增結(jié)果顯示，黑楊中EBP1 候選基因全長cDNA 約為 1.2

9、 kb （圖 1 ）。將獲得的 cDNA 通過 T-A 克隆方法，連入 pEASY-T 載體，挑取陽性克隆進行測序。測序結(jié)果顯示，楊 樹中 EBP1 基因全長 cDNA 序列長度為 1 215 bp ，將其命名為 PtEBP1 。楊樹 PtEBP1 的生物信息學(xué)分析 根據(jù)測序結(jié)果，對獲得的 PtEBP1 進行進一步的序列分析。同源性比對結(jié)果顯示， PtEBP1 與已報道的沙冬青和馬鈴薯 EBP1 基因 具有較高的同源性，其中與沙冬青EBP1 蛋白序列的同源性為 89%與馬鈴薯 EBP1 蛋白同源性為 87% （圖 2）。保守結(jié)構(gòu)域 分析 結(jié)果顯示 PtEBP1 含有 1 個 PA2G4-lik

10、e-domain ，這個結(jié)構(gòu) 域?qū)儆?APP_MetAP 超家族（圖 3）。由此推測楊樹 PtEBP1 基因應(yīng)屬于轉(zhuǎn)錄 因子 APP_MetAP 超家族的一個成員。PtEBP1 表達(dá)載體的構(gòu)建為對 PtEBPI 的功能及作用機制進行探究，本試驗進一步對PtEBP1 植物表達(dá)載體進行構(gòu)建。 首先通過對 PtEBP1 的序列分析，結(jié)合pBI121載體酶切位點信息，確定選用Xbal和Sacl對PBI121 載體進行切割；隨后設(shè)計帶有 Xbal 和 SacI 切割序列的 引物 PtEBPI-F : 5 -TCTAGAATGTCGTCAGACGACG AGA- PtEBPI-R: 5 A -GAGCTC

11、CTAGACGGCGGT 將擴增序列通過 T-A 克隆方法導(dǎo)入 pEASY-T1 質(zhì)粒，挑取陽性克 隆并提 取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行 Xbal 和 SacI 雙酶切消化處理后， 獲得帶有雙酶切位點的目的片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的 pBI121 的載體進行連接（圖 4）。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素抗 性的 LB 平板上篩選陽性克隆， PCR 僉測顯示陽性重組 克隆中含有 1.2 kb 的目的片段；陽性重組克隆進一步經(jīng)過 Xbal 和 SacI 雙酶切后也能產(chǎn)生 1.2 kb 的目的片段 （圖 5）。這表明楊樹 EBP1 基因已成功構(gòu)建入植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體 pBI121 中。農(nóng)桿菌

12、 LBA4404 中表達(dá)載體的菌液 PCF 鑒定采用凍融法將已 構(gòu)建好的表達(dá)載體 pBI121-PtEBP1 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（ LBA4404 ）感受態(tài)細(xì) 胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB 固體培養(yǎng)基上進行篩選。 隨機挑取 4 個陽性克隆進行菌液 PCR， PCR 擴 增產(chǎn)物均為 1.2 kb （圖 6），證明表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。3 結(jié)論與討論EBP1 是擬南芥中和人類 ErbB-3 表皮生長因子受體結(jié)合蛋白 同源 的一個基因， 與核糖體的生物合成有關(guān)， 可以同時控制細(xì)胞 的分裂和延伸， 從細(xì)胞數(shù)量和體積 2 個方面同時調(diào)控植物器官大 小。 EBP1 基 因以劑量依賴型方式調(diào)節(jié)植物器官大小

13、，同時也以 生長素依賴形式對細(xì) 胞周期調(diào)節(jié)因子進行調(diào)控 12 ，該基因與蛋 白合成密切相關(guān)， 并參加 調(diào)控細(xì)胞周期， 在調(diào)節(jié)植物器官大小方 面具有重要意義。楊樹是重要的用材和綠化樹種，具有經(jīng)濟和生態(tài)雙重價值。 但和其 他絕大多數(shù)木本植物一樣， 楊樹生長周期也較長， 遺傳背 景復(fù)雜，很 難在短時間內(nèi)創(chuàng)造出大量突變體。因此，長期以來對 楊樹等木本植物器 官形態(tài)建成及生長發(fā)育調(diào)控機制等基本問題 的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于擬南芥等 草本植物。而 2006 年楊樹全基因組 測序的完成 21 及隨后不斷豐富完 善的楊樹及其近源種的 EST 數(shù)據(jù)信息， 為采用生物信息學(xué)手段結(jié)合反 向遺傳學(xué)策略探究楊樹 生長發(fā)育機制等基本問題提供了一條有效途徑。本研究通過克隆獲得的楊樹 PtEBP1 基因應(yīng)屬于