流式細胞儀基礎知識介紹課件

1、1流式細胞儀基礎知識介紹1流式細胞儀基礎知識介紹1流式細胞儀基礎知識介紹目錄流式細胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細胞儀的結構和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析目錄流式細胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細胞儀的結構和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析目錄流式細胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細胞儀的結構和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀的定義流式細胞術（flow cytometry , FCM）：是一種定量分析技術，是指利用流式細胞儀檢測細胞特異性標記熒光信號而測定細胞的多種生物物理性質的方法，同時也是一項可以把具有某相同熒光信號特性的某些細胞亞群從多細胞群體中分離和富集出來的細胞分析技術。流式細

2、胞儀(flow cytometer)： 是一種集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術和抗原抗體檢測技術為一體的新型高科技儀器。 流式細胞儀的檢測特點單細胞懸液或生物顆粒 分析速度高多參數(shù)精度高當代最先進的細胞定量分析技術光信號流式細胞儀的檢測范圍 檢測范圍：凡細胞內能進行熒光標記的成分或變化都可用流式細胞儀進行檢測。RNA含量細胞大小細胞顆粒度細胞表面面積DNA含量與細胞周期蛋白質含量鈣離子，PH值,膜電位細胞結構特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內細胞因子細胞活性酶活性激素結合位點細胞受體細胞功能流式細胞儀的分類分析型 自動化程度高，操作簡單，適用于臨床使

3、用；分選型 分辨率高，多激光高配置，可將感興趣的細胞分選出來，適用于科研使用；常見分析型流式細胞儀常見分選型流式細胞儀目錄流式細胞儀的結構與原理流式樣本的前處理流式細胞儀的定義和分類流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀的結構及原理液流系統(tǒng)液流驅動原理光學系統(tǒng)信號產(chǎn)生與收集原理電子系統(tǒng)信號檢測原理液流系統(tǒng)主要作用：提供穩(wěn)定的鞘流，將樣本懸液聚焦在光束中心處以供檢測； 主要部件：流動室（對于分選型也叫噴嘴）、管路、閥門樣本流實現(xiàn)方式： 負壓驅動樣本流：BD ： FACSVerse、Acurri C6 ， Mindray ：BriCyte E6 正壓實現(xiàn)樣本流：BD ：FACSCanto、Calibur、

4、Aria， BCI ： FC500、Gallios 液流驅動原理鞘液流動室樣本鞘液樣本流進樣針流動室主要作用：提供光源、產(chǎn)生并收集光信號主要部件：激光器、透鏡、濾光片光學系統(tǒng)BriCyte E6儀器的光學系統(tǒng)圖激光器 藍光 488nm 紅光 638nm 紫光 405nm 紫外光 355nm 綠光 532nm （注：根據(jù)其激發(fā)波長區(qū)分）信號產(chǎn)生要素之一信號產(chǎn)生要素之二熒光素 常見熒光素及其激發(fā)激光器信號產(chǎn)生要素之三熒光染色熒光素角色熒光標記熒光素熒光素抗體攜帶抗原的細胞信號產(chǎn)生原理濾光片長通濾片短通濾片帶通濾片波長大于特定功能的光可以通過，波長小于該波長的光被反射波長小于特定功能的光可以通過，波

5、長大于該波長的光被反射波長在某特定范圍內的光可以通過，波長在該范圍以外的光被反射480535580480535580530長通530短通530/30帶通480535580信號收集原理-濾光片 主要作用：接收、處理光信號；將光信號轉變?yōu)殡娦盘枺賹㈦娦盘枖?shù)字化；主要部件：光電二極管（PD)、光電倍增管（PMT）、信號處理板電子系統(tǒng)信號檢測原理信號檢測器光電二極管無電流放大作用信噪低光電倍增管（PMT）電流放大倍數(shù)可達106信噪比較光電二極管高tv脈沖高度（H）脈沖寬度（W）脈沖面積（A）信號類型脈沖信號熒光側向散射光前向散射光FSC檢測器FSC檢測器激光SSC檢測器SSC檢測器FL4FL6FL5

6、(PE-cy7)FL3(PerCP)FL2(PE)FL1(FITC)SS488/10530/30FS488/10585/40670LP785/60491/LP550LP645LP660/20785/60740LP反光鏡tvFL6(APC-cy7)FL4(APC)反光鏡tvtvtvtvtvtvtvFSCSSCFL1FL2FL3FL5流式細胞儀工作原理模擬圖配置：激光器數(shù)目和熒光通道數(shù)目；靈敏度：能檢測最小粒子的大小； 能檢測細胞上最少的熒光分子的數(shù)量（MESF）；分辨率：衡量儀器測量精度的指標（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子個數(shù)； 常用流式細胞儀術語目錄流式樣本的前處理流式細胞儀的結構域原理

7、流式細胞儀的定義和分類流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀實驗流程全血抗凝血培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋組織體液單細胞懸液熒光抗體標記上機檢測酶消化法機械法化學處理法細胞膜抗原標記細胞漿抗原標記膜漿抗原同時標記單色標記多色標記目錄流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細胞儀的結構域原理流式細胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細胞儀上機流程 開機建立模板儀器設置采集數(shù)據(jù)儀器質控流速停止條件電壓閾值PD或PMT控制可由用戶調節(jié)各通道互不干擾圖像上目標細胞位置隨電壓變化實時更改調整原則：通常使目標細胞位于中央或靠近中央位置各通道均可設置單通道閾值設置多通道orand組合去除噪聲及碎片低、中、高速低速樣本流最穩(wěn)定高速收集速

8、度最快時間體積粒子數(shù)特定目標細胞團在選定條件點自動停止測試儀器設置用戶可通過PC端軟件進行以下條件的設置，并可直觀觀察到變化，從而獲得滿意的結果。主要作用：數(shù)據(jù)分析、顯示主要部件：電腦工作站數(shù)據(jù)分析要素圖門數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖類型直方圖散點圖等高線圖密度圖三維立體圖圖坐標軸顯示線性坐標：將數(shù)據(jù)均勻的映射到各個像素點；一般用于顯示FSC和SSC數(shù)據(jù)對數(shù)坐標：數(shù)據(jù)做對數(shù)變換后均勻的映射到各個像素點 可以將大數(shù)據(jù)在坐標軸上壓縮，小數(shù)據(jù)在坐標軸上拉伸 可用于陽性標定范圍廣、但陰性標定信號低，線性坐標不易于分辨的情況雙指數(shù)坐標：數(shù)據(jù)做雙指數(shù)變換后均勻的映射到各個像素點 雙指數(shù)可解決對數(shù)坐標表示時小的部分過于放大及無法顯示負數(shù)的問題線性對數(shù)雙指數(shù) 設門：在細胞分布圖中確定一個范圍，對感興趣的細胞進行單參數(shù)或多參數(shù)析，獲得門內細胞的百分比等參數(shù)門不規(guī)則門&十字門區(qū)間門&二分門細胞百分比、絕對值均值、標準差、CV結果以何種形式呈現(xiàn)統(tǒng)計參數(shù)FITC530/30PE585/40數(shù)據(jù)分析熒光補償+FITC通道信號=PE通道信號=實測實測真實真實 流式細胞儀上