流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)介紹課件

1、1流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)介紹1流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)介紹1流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)介紹目錄流式細(xì)胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析目錄流式細(xì)胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析目錄流式細(xì)胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和原理流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細(xì)胞儀的定義流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry , FCM）：是一種定量分析技術(shù)，是指利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞特異性標(biāo)記熒光信號(hào)而測(cè)定細(xì)胞的多種生物物理性質(zhì)的方法，同時(shí)也是一項(xiàng)可以把具有某相同熒光信號(hào)特性的某些細(xì)胞亞群從多細(xì)胞群體中分離和富集出來(lái)的細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)

2、胞儀(flow cytometer)： 是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)和抗原抗體檢測(cè)技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒 分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)光信號(hào)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍：凡細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成分或變化都可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。RNA含量細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面面積DNA含量與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)含量鈣離子，PH值,膜電位細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞功能流式細(xì)胞儀的分類分析型 自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，適用于臨床使

3、用；分選型 分辨率高，多激光高配置，可將感興趣的細(xì)胞分選出來(lái)，適用于科研使用；常見分析型流式細(xì)胞儀常見分選型流式細(xì)胞儀目錄流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)與原理流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀的定義和分類流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及原理液流系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)原理光學(xué)系統(tǒng)信號(hào)產(chǎn)生與收集原理電子系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)原理液流系統(tǒng)主要作用：提供穩(wěn)定的鞘流，將樣本懸液聚焦在光束中心處以供檢測(cè)； 主要部件：流動(dòng)室（對(duì)于分選型也叫噴嘴）、管路、閥門樣本流實(shí)現(xiàn)方式： 負(fù)壓驅(qū)動(dòng)樣本流：BD ： FACSVerse、Acurri C6 ， Mindray ：BriCyte E6 正壓實(shí)現(xiàn)樣本流：BD ：FACSCanto、Calibur、

4、Aria， BCI ： FC500、Gallios 液流驅(qū)動(dòng)原理鞘液流動(dòng)室樣本鞘液樣本流進(jìn)樣針流動(dòng)室主要作用：提供光源、產(chǎn)生并收集光信號(hào)主要部件：激光器、透鏡、濾光片光學(xué)系統(tǒng)BriCyte E6儀器的光學(xué)系統(tǒng)圖激光器 藍(lán)光 488nm 紅光 638nm 紫光 405nm 紫外光 355nm 綠光 532nm （注：根據(jù)其激發(fā)波長(zhǎng)區(qū)分）信號(hào)產(chǎn)生要素之一信號(hào)產(chǎn)生要素之二熒光素 常見熒光素及其激發(fā)激光器信號(hào)產(chǎn)生要素之三熒光染色熒光素角色熒光標(biāo)記熒光素?zé)晒馑乜贵w攜帶抗原的細(xì)胞信號(hào)產(chǎn)生原理濾光片長(zhǎng)通濾片短通濾片帶通濾片波長(zhǎng)大于特定功能的光可以通過，波長(zhǎng)小于該波長(zhǎng)的光被反射波長(zhǎng)小于特定功能的光可以通過，波

5、長(zhǎng)大于該波長(zhǎng)的光被反射波長(zhǎng)在某特定范圍內(nèi)的光可以通過，波長(zhǎng)在該范圍以外的光被反射480535580480535580530長(zhǎng)通530短通530/30帶通480535580信號(hào)收集原理-濾光片 主要作用：接收、處理光信號(hào)；將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，再將電信號(hào)數(shù)字化；主要部件：光電二極管（PD)、光電倍增管（PMT）、信號(hào)處理板電子系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)原理信號(hào)檢測(cè)器光電二極管無(wú)電流放大作用信噪低光電倍增管（PMT）電流放大倍數(shù)可達(dá)106信噪比較光電二極管高tv脈沖高度（H）脈沖寬度（W）脈沖面積（A）信號(hào)類型脈沖信號(hào)熒光側(cè)向散射光前向散射光FSC檢測(cè)器FSC檢測(cè)器激光SSC檢測(cè)器SSC檢測(cè)器FL4FL6FL5

6、(PE-cy7)FL3(PerCP)FL2(PE)FL1(FITC)SS488/10530/30FS488/10585/40670LP785/60491/LP550LP645LP660/20785/60740LP反光鏡tvFL6(APC-cy7)FL4(APC)反光鏡tvtvtvtvtvtvtvFSCSSCFL1FL2FL3FL5流式細(xì)胞儀工作原理模擬圖配置：激光器數(shù)目和熒光通道數(shù)目；靈敏度：能檢測(cè)最小粒子的大小； 能檢測(cè)細(xì)胞上最少的熒光分子的數(shù)量（MESF）；分辨率：衡量?jī)x器測(cè)量精度的指標(biāo)（CV）；分析速度：指每秒分析的粒子個(gè)數(shù)； 常用流式細(xì)胞儀術(shù)語(yǔ)目錄流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)域原理

7、流式細(xì)胞儀的定義和分類流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)流程全血抗凝血培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋組織體液?jiǎn)渭?xì)胞懸液熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測(cè)酶消化法機(jī)械法化學(xué)處理法細(xì)胞膜抗原標(biāo)記細(xì)胞漿抗原標(biāo)記膜漿抗原同時(shí)標(biāo)記單色標(biāo)記多色標(biāo)記目錄流式數(shù)據(jù)的獲取和分析流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)域原理流式細(xì)胞儀的定義和分類流式樣本的前處理流式細(xì)胞儀上機(jī)流程 開機(jī)建立模板儀器設(shè)置采集數(shù)據(jù)儀器質(zhì)控流速停止條件電壓閾值PD或PMT控制可由用戶調(diào)節(jié)各通道互不干擾圖像上目標(biāo)細(xì)胞位置隨電壓變化實(shí)時(shí)更改調(diào)整原則：通常使目標(biāo)細(xì)胞位于中央或靠近中央位置各通道均可設(shè)置單通道閾值設(shè)置多通道orand組合去除噪聲及碎片低、中、高速低速樣本流最穩(wěn)定高速收集速

8、度最快時(shí)間體積粒子數(shù)特定目標(biāo)細(xì)胞團(tuán)在選定條件點(diǎn)自動(dòng)停止測(cè)試儀器設(shè)置用戶可通過PC端軟件進(jìn)行以下條件的設(shè)置，并可直觀觀察到變化，從而獲得滿意的結(jié)果。主要作用：數(shù)據(jù)分析、顯示主要部件：電腦工作站數(shù)據(jù)分析要素圖門數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖類型直方圖散點(diǎn)圖等高線圖密度圖三維立體圖圖坐標(biāo)軸顯示線性坐標(biāo)：將數(shù)據(jù)均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn)；一般用于顯示FSC和SSC數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)坐標(biāo)：數(shù)據(jù)做對(duì)數(shù)變換后均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn) 可以將大數(shù)據(jù)在坐標(biāo)軸上壓縮，小數(shù)據(jù)在坐標(biāo)軸上拉伸 可用于陽(yáng)性標(biāo)定范圍廣、但陰性標(biāo)定信號(hào)低，線性坐標(biāo)不易于分辨的情況雙指數(shù)坐標(biāo)：數(shù)據(jù)做雙指數(shù)變換后均勻的映射到各個(gè)像素點(diǎn) 雙指數(shù)可解決對(duì)數(shù)坐標(biāo)表示時(shí)小的部分過于放大及無(wú)法顯示負(fù)數(shù)的問題線性對(duì)數(shù)雙指數(shù) 設(shè)門：在細(xì)胞分布圖中確定一個(gè)范圍，對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)析，獲得門內(nèi)細(xì)胞的百分比等參數(shù)門不規(guī)則門&十字門區(qū)間門&二分門細(xì)胞百分比、絕對(duì)值均值、標(biāo)準(zhǔn)差、CV結(jié)果以何種形式呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)參數(shù)FITC530/30PE585/40數(shù)據(jù)分析熒光補(bǔ)償+FITC通道信號(hào)=PE通道信號(hào)=實(shí)測(cè)實(shí)測(cè)真實(shí)真實(shí) 流式細(xì)胞儀上