熒光顯微鏡構(gòu)造和應(yīng)用

1、熒光顯微鏡構(gòu)造和應(yīng)用Fluorescence microscopyMainly fluorescence detector systems are color-blind!(Colors are based on a pseudo-color look-up table)熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：檢出能力高對細胞的刺激小能進行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析什么是熒光 ? 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。 一種光化熒光 Basic idea of

2、fluorescence microscopy: Stokes shiftE = hnc = lnE 1 / l熒光的種類.自發(fā)熒光（不加染色） ;.二次熒光（用化學(xué)染色） ;.抗體熒光技術(shù)（用免疫染色）;自發(fā)熒光：有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。 激發(fā)光發(fā)射光二次熒光（用化學(xué)染色） 非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進行觀察。對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細胞區(qū)別出來而可以觀察到?？贵w熒光技術(shù)（用免疫染色） :利用特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)

3、合這一個事實，有意識地使帶熒光標記的抗體和標本中的抗原進行抗原/抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能通過抗體的熒光觀察到。熒光的性質(zhì)吸收光保持固有的熒光特性熒光波長激發(fā)波長（STOKES 法則）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率 熒光顯微鏡的種類 透射式 落射式熒光顯微鏡的主要部件 透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡 落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡暗視野照明方式 聚光鏡中央有檔光片，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。dark field without sp

4、ecimenobject planeobjectivecondensorBright and dark field illumination- ring diaphragm (usually)- dark field condensorspecimendark field with specimenBright and dark field illuminationBright field total illumination of the specimen direct light collection by objective dark/colored object on bright b

5、ackgroundObjects with a sharprise in refraction indexDark field part-illumination of the specimen scattered light collected by objective bright object on dark backgroundObjects with high contrast(with modification )透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護罩孔徑光欄（FS）視場光欄（AS）Immersion

6、objectives: Remember the refraction index!Immersion objectivewith specimenrefraction index (n)air EmissionExcitationDMLightsourcemedium (water or oil)water or oil immersion objectivespecimen 透射熒光顯微鏡 優(yōu)點： 由于用了暗場聚光鏡，激發(fā)光不能進入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同樣的原因，任何物鏡都可用于觀察。 用低倍物鏡時，比反射熒光顯微鏡更亮。 透射熒光顯微鏡 缺點： 必須正確

7、調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。 由于暗視場聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。 視場照明區(qū)不能過大，否則容易使熒光標本熒光色衰褪。 厚的或不透明的標本不適用。 反射熒光顯微鏡 優(yōu)點： 由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。 采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。 物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時，也可以獲得高分辨率的像。 厚的或不透明的標本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。 其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。 可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象。 反射熒光顯微鏡 缺點： 在用低倍率物鏡時，像比較暗，因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡。 濾光鏡

8、系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。 落射熒光顯微鏡各部件特性和作用 汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G) 激發(fā)濾色鏡:波長選擇nmT%BAND PASS落射熒光顯微鏡各部件特性和作用 吸收濾色鏡:透過熒光,阻擋雜光 分色鏡:反射激發(fā)光,透過熒光A 透過AA 反射BB 透過B 阻擋nmnmT%T%落射熒光顯微鏡原理汞 燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物 鏡 標 本透射熒光顯微鏡原理 目鏡吸收濾色鏡 物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡 汞燈濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡激發(fā)濾色鏡的選擇激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡FITC 吸收FITC 發(fā)射分色鏡-激發(fā)濾色鏡的帶寬應(yīng)

9、盡量符合熒光色素的特性激發(fā)濾色鏡帶寬對圖象的影響SWB: BP420-480WB: BP450-480WIB: BP460-490NB: BP470-490FITC+PI多重染色標本的多色觀察DAPI+FITC+Texas Red-選用特制的多色濾色鏡三色濾色鏡的特性曲線激發(fā)分色吸收雙重染色標本的單色和雙色觀察 NUA WIB DUAL BAND (特制）WIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI-選用單色和雙色濾色鏡單色濾色鏡的特性曲線雙色濾色鏡的特性曲線現(xiàn)行熒光顯微鏡特點和各種濾色鏡 激發(fā)/分色/吸收一體化 - CUBE 同時安裝4組或6組CUBE(另可提供8組型) 數(shù)十種通用和專用CUBE供選擇Free Cube吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡根據(jù)需要隨意選擇各種波長濾色鏡早期熒光顯微鏡早期熒光顯微鏡附件有很多輔助濾色鏡早期熒光濾色鏡特點寬帶激發(fā)輔助激發(fā)和輔助吸收濾色鏡的特性輔助激發(fā)濾色鏡的運用輔助吸收濾色鏡的運用激發(fā)分色 吸收 熒光輔助吸收雜光nmT%油鏡應(yīng)使用熒光油物鏡光欄的運用光欄全開啟光欄適當關(guān)小物鏡光欄適當調(diào)節(jié)物鏡光欄以獲得最佳效果熒光的衰減 防衰減的方法使用抗衰減劑選擇衰減小的熒光素降低激發(fā)光強度降低標本中氧的濃度有衰減的標本使用抗衰減劑的效果廣泛應(yīng)用的抗衰減劑使用要點標