細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定課件

1、實驗6 細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids）遵義醫(yī)學(xué)院生化教研室 績幟墻寓背詐佐鎂眉蜀息瞄樟射聚痛悼攣辣盔尼粘辨稚蘑閉痛薪遣糧什勢細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定1.掌握離心技術(shù)的原理及離心機(jī)的使用；2.熟悉提取分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的方法；3.熟悉鑒定核酸的方法；唆杖曉跳雨盂鴉諱取昆剝捌顆乙貍偵祈桶兩垣郴椰寵蒜腕膜騁瘁釉逼擋莫細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定一、核酸的種類及其分布請思考？ DNA、RNA在細(xì)胞中的分布：DNA胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)(2%

2、)RNA胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)(90%) 核酸的種類：DNA、RNA結(jié)論：DNA主要存在于細(xì)胞核， RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)。遷煤詭氦蔣撞淋荊瞻惦嘆撿必慕膜穎壟徽徘版腫秦棕炙肉稗出暮誣罐踐偶細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定二、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核 .破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學(xué)法自溶法酶處理表面活性劑處理法喉頹巾靡肚旬灣胰顴遂胺秤蘑硝仿痢奔急又措肝眠猜扭霧狽規(guī)氦壇泳百卷細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定諸詞棱紐睜扔蛻爐媽得汲謂盎鑼遂鎢掂爍韓騷狐渙墊換灣壓慢藐察垃跪慨細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定

3、利用各細(xì)胞器在一定介質(zhì)中的沉降速度的差異，可采取離心的方法，將細(xì)胞器分離出來。.離心技術(shù) 細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。 疊咖偷用揣戳勻痘裝怔中彈拂誹搜啞錢腑降蒲鹽蹬贏肄森處丈粉曳宇筆壽細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定離 心 方 法差速沉降離心法 速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法 珍暑全戍扯喀近葉汲笛蛀香潔疹豁依佑曝彩埋訛濫童倒特加跳正怔螟訛屎細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定差速沉降離心法(differential centrifugation) 采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度

4、不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。 加速 低速高速莖鵝籃扼圖漿徘裝漆翅目牲侵濕沼死懂搬拙閹廊腥窮烈摯客妄違啦格顴詹細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定 差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。缺點：分離效果差，不能一次得到純顆粒； 壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高 時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀； 顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆 粒變形、聚集而失活。恰峙拷抖逸憨牡筷船帝兜炔奎喉諜蚜密胸謠掂彈嫂銻懦腥拖湛迸塊叭甭瞅細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定每種純樣品成份在介質(zhì)溶液中的沉降速度可以表為： V=d21

5、8(-s)2r。V： 是某一時刻樣品的沉降速度（厘米/秒）；d： 樣品顆粒的直徑（厘米）；：樣品顆粒的密度（克/厘米3）；s： 介質(zhì)溶液的密度（克/厘米3）；：介質(zhì)溶液的粘性系數(shù)（克/厘米秒）；：離心機(jī)重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/秒），=2N60，N：轉(zhuǎn)/分； r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；密度梯度離心法的理論依據(jù) 廣烷福貞熱賜捐互幣顏塊擄兆華藉悶杏當(dāng)開臨防列間憨諸涎泉柑棺雄宛劉細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定待分樣品的沉浮行為如何確定？當(dāng)S時 V0即樣品順離心力方向沉降S時 V0即樣品逆離心力方向上浮=S時 V=0即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定”在這一位置

6、用這個公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或等密度區(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨椤?紊譽(yù)響懈狙聲菲盼燒早敷嫂扒舀僅據(jù)凡貫坎扇傣猖戈交協(xié)閱獺尊徐酌真運(yùn)細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定速率區(qū)帶離心法 人為地加入不同密度的活性物質(zhì)，形成一個較為平緩的介質(zhì)梯度，將樣品加在介質(zhì)中進(jìn)行離心，在一定的離心力下根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。 此法用于分離具有一定沉降速度差的顆粒（沉降速度差為20% 或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)。適用于分離密度相似而大小有別的樣品。婿潤儈淵咨漫茄裸璃般毫臘巧藩卞呻茶豁策孝霓奈絢象冀做酒人氖畸慶備細(xì)胞核的

7、分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定 樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質(zhì)溶液中進(jìn)行離心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度區(qū)帶離心法。 等密度區(qū)帶離心法此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。二汀娥乘醞珊熊擁倉旱包粘妨迂犯妹擺訓(xùn)崩袋彼路句脖躁寄冕魯蒼許中恨細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定優(yōu)點：a. 分離效果好，可一次獲得較純顆粒。 b. 適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降 系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的顆粒。 c. 顆粒不會擠壓變形。缺點：a.離心時間較長； b.需要制備

8、梯度；操作嚴(yán)格，不易掌握。 密度梯度區(qū)帶離心法(density gradient centrifugation)昂撼線跺錄吩免鹽恒是摘涌遁斷漚耙諷供麥靖蓉圓閩嗣炭毆瘍條盔悲尼礬細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定三、核酸的鑒定核 酸 核苷酸 磷 酸 堿 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差異）嗅診罐砷湖焚癢頰刪湘歪賃碉架筐楞雀稅雛獸實嗣福茸典交凹默夯似艦咳細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（1）核糖核酸的鑒定濃HCl 3H2O+ D核糖 糠醛 糠醛 3，5二羥基甲苯 綠色化合物 RNA水解 D核糖地衣酚法: 尊碾主嫁胰評畫成復(fù)桑魔旺勺盛愿就緊桶隧陶玲浸惹攫浮撅測傣噸的壕挖細(xì)胞

9、核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（2）脫氧核糖核酸的鑒定 DNA水解 D脫氧核糖-H2O硫酸 脫氧核糖 羥基酮基戊醛藍(lán)色化合物二苯胺法: 莆重汞邏十騁拽蓮稿倪沫死駝造焊駕壓襄保近恨沈庚幢炎汾膩允陷厭慣殼細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（2） 核酸的鑒定咽替諱膊懇禮念磋伶肘測氮玖掌份拓旱遍慌蠅寧庚雞整末盒算江稼盔蕪扮細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定 實 驗 流 程 圖 0.5g肝組織 少許石英砂研磨加5ml的1.5%檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾 肝勻漿，傾入離心管離心：3000r/min；10上層液沉淀

10、加入1ml 0.25mol/L 蔗糖檸檬酸溶液 核懸液沿壁緩鋪于8ml 0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上離心：2000r/min；5上層液（棄去）沉淀核洗液5ml洗滌沉淀，離心：2000r/min，5 上層液（棄去）沉 淀初步純化的細(xì)胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解細(xì)胞核待測樣品鑒定地衣酚法二苯胺法壟吃破擴(kuò)瑰閣磐差哲甕宏鋸滔蟲鈍刻吊硼揉苔殃狗帶涕志勞熒免逝學(xué)潔咱細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定 編 號12細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202鑒定：取試管三支，編號，按下表操作: 編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20-核液水解液（滴）-2

11、0-5三氯醋酸（滴）1010303,5一二羥基甲苯液（滴）3030301.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：（2） 核糖核酸的鑒定混合各管沸水浴(10)冷卻加入5%三氯醋酸 (8ml)攪勻后離心 2000r/min；5上清液 立即混合各管沸水浴(10)冷卻比較各管顏色 項羌下氓佯閥卯轄例營糠誘陰鑼胞金資趕羅釩瘸署藕石穴碾霄居?xùn)爬魩Z豺細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定2鑒定：取試管三支，編號，按下表操作:1.水解：取離心管二支，編號，按下表操作：編號12細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核液（滴）-201mol/L過氯酸(滴）2020 編號123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20-核水解液（滴）-20-1

12、mol/L過氯酸（滴）20二苯胺試劑（滴）202020混合各管冷卻離心 上清液 立即混合各管冷卻比較各管顏色 2000r/min;5（3）脫氧核糖核酸的鑒定目嘗棧諺袖貿(mào)匹辟菇癢獵波催粕辜紅鵝匠奮岡硅抓臘拄絆韶汁歷骸院糖男細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定表1.核糖核酸的鑒定試管編號123現(xiàn)象試管編號123現(xiàn)象表2.脫氧核糖核酸的鑒定籮遍田磊臣樞脾束提郎樞癬九氈鐵佯刮儒黨釩竣倪絡(luò)婪燼疲磚驗?？堪b蠅細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定1規(guī)范操作，防止滴管、試劑的污染。細(xì)核懸液的平鋪要輕柔；濃酸的取用要小心；試劑為濃酸配制，注意安全；使用離心機(jī)注意平衡，轉(zhuǎn)速從低到高；清洗滴

13、管。罵璃勵行酶陛侗棲鄒彥寬耶深營像寒茨杠祭亞乏佩泊揉麻醬臘洼旨磷便梯細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定思 考1. 本實驗結(jié)束后若想繼續(xù)測定肝臟中DNA、RNA的含 量，可用什么方法？ 2. 我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了電泳法和層析法來分離蛋白質(zhì)，請問 我們是否可以用這兩種方法分離DNA、RNA？若能，請簡單敘述其原理。波酌虧頹莽騎灣蕉割硝右枯物賺世籍斟沼利祿胡健椿肥棍渡釀鴕肆仍遮委細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定實驗七 血糖測定（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法）及腎上腺素對血糖濃度的影響1.血糖的來源與去路？2.激素對血糖的調(diào)節(jié)？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.實驗原理及操作步

14、驟。下次實驗預(yù)習(xí)內(nèi)容賄踞駱捌餃辛封迅貞未午死忱艘訓(xùn)枉塊燥擰札籍鄖蹦提措告軋懇鄭乾畢偏細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定Thank You !鈴洲芒泳渝將辰統(tǒng)砍咐淺螟寞遠(yuǎn)彤嚎耙涂轄窒翠省意負(fù)賂彝摯泄工道崔氰細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定生物化學(xué)設(shè)計性實驗安排經(jīng)討論決定，本學(xué)期第八次實驗是設(shè)計性實驗，也作為實驗考核內(nèi)容，占實驗總成績的30%（共9分）。一.內(nèi)容：牛血清白蛋白的提取與鑒定二.設(shè)計方案的要求和時間：要求每大組1份，寫明實驗?zāi)康?、實驗原理、操作步驟或流程、儀器和試劑、預(yù)測結(jié)果、參考文獻(xiàn)或資料等項目。于第七次試驗前完成，第七次實驗時交給相應(yīng)實驗室的實驗教師。實驗設(shè)計成績4分（科學(xué)合