病毒滴度的測定課件

1、病毒滴度的測定原理(重點)：適當稀釋的病毒懸液與長成單層的宿主細胞混合，在細胞上覆以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等固體或半固體介質(zhì)，由于瓊脂的限制，病毒只能感染并破壞臨近的細胞，造成細胞溶解而形成空斑，每個空斑由一個病毒顆粒造成，計算空斑數(shù)量再乘以稀釋倍數(shù)即可得知原來的病毒感染單位的濃度?？瞻咝纬蓡挝环y定病毒滴度 空斑形成單位（Plaque Forming Units, PFUs)空斑顯現(xiàn)原理(掌握)：空斑形成后，經(jīng)中性紅活細胞染色，活細胞顯示紅色，而空斑區(qū)細胞不著色，形成不染色區(qū)域?？瞻咝纬蓡挝环y定病毒滴度Procedures適用條件(熟悉)：凡是能在細胞中產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)(CPE)的病毒都可以采用空

2、斑形成法測定病毒滴度。空斑形成單位法測定病毒滴度中性紅(掌握)(熟悉)(了解)(了解)空斑形成單位試驗技術(shù)舉例 p51-52防止瓊脂凝固；Hanks液？雙抗？5% CO2空斑形成單位的計算 (重點)(掌握)(熟悉)CCID50ID50LD50(重點)(熟悉)5% CO2培養(yǎng)箱(熟悉)CCID50TCID50(熟悉)病毒液 CPE孔數(shù) 無CPE 累 計 出現(xiàn)CPE孔稀釋度 孔數(shù) CPE孔數(shù) 無CPE孔數(shù) 所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8 0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6

3、 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21）Reed-Muench法計算CCID50CPE(陽性)孔累計數(shù)由下向上累積無CPE(陰性)孔累計數(shù)由上向下累積(難點、重點)CCID50(難點、重點)Calculation of TCID50 Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)Karber法計算CCID50 病毒液稀釋度 出現(xiàn)CPE孔的比率10-1 8/8=1 10-2 8/8=110-3 7/8=0.8751

4、0-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0(難點、重點)lgCCID50=L+d(s-0.5)L: 病毒的最低稀釋倍數(shù)的對數(shù) L=lg10-1 = -1d：稀釋系數(shù)，即組距 d=lg10-1 = -1S：CPE(陽性)孔比率總和lgCCID50=(-1) + (-1)(3.375-0.5) =-3.875 CCID50=10-3.875/0.1ml ID50 和 LD50 的計算與CCID50完全相同(掌握)lgCCID50=L+d(s-0.5)ID50 計算，S：感染比率總和；LD50 計算，S：死亡比率總和；(掌握)血凝試驗的基本原理(掌握)紅細胞凝集現(xiàn)象(血凝現(xiàn)象)紅細胞凝集抑制 (紅細胞與抗體結(jié)合，失去血凝)血凝滴度/血凝單位血凝試驗測定病毒滴度干擾滴定測定病毒滴度小結(jié)主要介紹空斑形成單位法、50%終點法、血凝試驗和干擾滴定法測定病毒滴度的原理及其方法；重點要掌握空斑形