植物病害檢疫檢驗技術真菌

1、第四章 植物病害檢疫檢驗(jinyn)技術 共七十二頁第一節(jié) 植物檢疫(jiny)性真菌常見檢疫(jiny)檢驗技術直接檢驗比重檢驗染色檢驗洗滌(xd)檢驗保濕萌芽檢驗分離培養(yǎng)檢驗共七十二頁1、適用范圍 混雜在種子間的較大病原體（線蟲癭、菌核(jn h)） 污染大量病菌孢子的種子（小麥腥黑穗?。?種子帶明顯病癥的病粒（小麥黑胚病）（一）直接檢驗(jinyn)-肉眼檢驗(jinyn)小麥黑胚病粒腥黑穗病共七十二頁 在檢查時應先進行外表和周圍(zhuwi)的檢查，然后，由表及里仔細觀察病害癥狀、菌癭、菌核等病癥。 對于苗木、接穗、插條等，應注意莖、葉、芽、根各部位，并需檢查粘著和夾帶的土壤。 對塊

2、莖、塊根以及鱗莖，應特別注意芽眼、凹陷處、傷口和附著的土壤。主要工具(gngj)：放大鏡或解剖鏡。檢查要求：共七十二頁2、檢驗方法： 將送驗樣品分出一半試樣，放在白紙或白色塘瓷盤中，檢出線蟲癭、麥角菌、黑粉菌球、菌核(jn h)及病粒，稱其重量，計算病害感染率。病害感染率 (%)=?。＃┰w重量(g)試樣重量(g)100%共七十二頁3、注意 無病征的種子不一定是無病的種子。 不同的病害可以表現(xiàn)類似的癥狀， 同一病害也可產(chǎn)生不同的癥狀。 在確定某種病害時，須與其他方法(fngf)配合使用。共七十二頁1、適用范圍 檢查混雜(hnz)在種子內(nèi)較大的病原體如菟絲子、菌核、線蟲癭和雜草種子等。 利用病

3、原體與種子形狀、大小的不同，通過一定的篩孔將病原體篩出來，然后進行分類稱重。 （二）過篩(u shi)檢驗大豆菟絲子為害共七十二頁2、檢驗方法 將送驗樣品分出一半(ybn)作為試樣，用規(guī)定孔徑的篩子過篩。 各層樣品倒入白瓷盤內(nèi)檢查，最下層的雜質(zhì)倒入黑玻璃盤中用肉眼或放大鏡檢查。病原體含量(hnling)(%)=病原體重量(g)試樣重量(g)100過篩檢驗主要用于檢驗糧谷、種子、油料、干果和生藥材。共七十二頁1、適用范圍：種子(zhng zi)表面帶病而肉眼看不見的種子(zhng zi)病害。（附著在種子表面的病菌孢子）（三）洗滌(xd)檢驗小麥矮腥黑穗病菌 共七十二頁 洗滌檢驗法原理：主要用于

4、檢查附著在種子表面的各種真菌孢子。種子表面常附著真菌孢子，將一定量的樣品(yngpn)放入容器內(nèi)，加一定量的無菌水，充分振蕩，可使病菌孢子洗滌下來，而后離心后，可沉淀，鏡檢沉淀物可確定其種類和數(shù)量。主要儀器和試劑：振蕩器、離心機、顯微鏡、0.1吐溫溶液等共七十二頁2、檢驗方法： 樣品制備：取樣(5g)2份于100ml三角瓶內(nèi)，加蒸餾水10ml（加0.1吐溫溶液），振蕩510min， 顯微計數(shù)：懸浮液20003000r/min離心515min，吸去上清液，留1ml沉淀部分(b fen)，滴于5個載玻片，加蓋玻片鏡檢，每片檢查10個視野，并計算每視野平均孢子數(shù)N=n1n2n3/m式中： N每克種子

5、的孢子(boz)負荷量 n1每視野平均孢子數(shù) n2蓋玻片面積上的視野數(shù) n31ml水的滴數(shù) m供試樣品的重量（g）共七十二頁 如果鏡檢洗滌液時，沒有檢查到病菌孢子，則對同一樣品要重復(chngf)幾次取樣洗滌，對每一洗滌液至少要鏡檢5張玻片。當一個樣品兩次取樣，洗滌檢驗的結(jié)果相差很大時，則需要重復(chngf)一次。共七十二頁檢驗結(jié)果有四個影響因素： a種子或其他糧谷類產(chǎn)品表面所粘附的病菌(bngjn)孢子，不一定能完全洗滌下來。 b在離心管內(nèi)，懸浮液表面常形成一層極難沉降的孢子薄膜，而管壁上也可能(knng)粘附著孢子，使檢驗結(jié)果很難代表實際情況，因而影響計算的準確性； c將懸浮液滴于玻片時

6、，由于孢子迅速沉淀，造成一些視野間孢子分布極不均勻，這也影響計數(shù)的準確性，都可能增加誤差程度； d操作不夠嚴格，會造成人為誤差，以及制樣中也會出現(xiàn)偏差。共七十二頁 原理：由于菌癭、菌核、病秕粒，都要比健康(jinkng)籽粒輕。若將其浸入一定濃度的食鹽水（糖、泥土等）或其他溶液中時，就會浮于液面。撈取浮物，結(jié)合解剖鏡進行檢驗，即可鑒定其種類。（四）比重(bzhng)檢驗法比重檢驗法一般用于檢驗種子、糧谷、豆類中的菌癭、菌核和病秕籽粒等。共七十二頁 原理(yunl)：某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原物本身，?？捎锰厥獾幕瘜W藥品處理，使其染上特有的顏色，幫助檢出和區(qū)分病蟲種類。這種方法即

7、為染色檢驗法。例如：馬鈴薯癌腫?。ㄊ韷K上癌瘤不明顯時，可做徒手切片，加1滴1的“藏花紅”染色液，健康組織細胞壁呈亮紅色，感病組織細胞壁呈暗紅色。麥類赤霉病的檢驗：將病粒放在0.5-1%對硝基苯胺酒精溶液中，經(jīng)2-3小時，受侵染部分或有菌絲分布的部分呈現(xiàn)暗紅色至咖啡色，而未受侵染部分為黃色，50溫度下顏色更明顯。（五）染色(rns)檢驗法共七十二頁（六）解剖(jipu)檢查法有許多病害或一些病害初發(fā)生階段，在種子(zhng zi)、苗木及其他植物產(chǎn)品表面沒有明顯的癥狀，診斷比較困難有時為要了解病原物潛伏的場所，常常需要用解剖檢驗進行鑒定，如散黑穗病菌以菌絲體在胚中越冬,有的果樹病害以菌絲體在花芽

8、或鱗片中越冬。共七十二頁 解剖檢驗主要采用(ciyng)徒手切片或切片機切片，經(jīng)過染色，制成玻片標本后，放在顯微鏡下觀察鑒定。對于某些病害或種子苗木及其產(chǎn)品，有時采用(ciyng)粗放的解剖方法也可進行檢查。 共七十二頁（七）保濕萌芽檢驗原理：種子攜帶的真菌，無論外表黏附的還是潛伏種子內(nèi)的，在種子萌發(fā)階段即可開始(kish)侵染，甚至有些在種子還未萌發(fā)時就可長出病菌。主要儀器及試劑：吸水紙、沙土、冰箱、培養(yǎng)箱等。常規(guī)(chnggu)植物病理學方法共七十二頁 保濕萌芽檢驗的方法： 1、保濕培養(yǎng)(piyng)檢驗 2、沙內(nèi)萌芽檢驗 3、土內(nèi)萌芽檢驗 4、試管幼苗癥狀測定共七十二頁 1保濕培養(yǎng)檢驗

9、此法一般(ybn)又分為：吸水紙法、冰凍吸水法和瓊脂平皿法等。 (1) 吸水紙法 廣泛用于各種類型的種子(zhng zi)，包括禾谷類、豆類、麻類、煙草、各種蔬菜、觀賞植物和樹木種子(zhng zi)等種傳真菌病害的檢驗。 共七十二頁吸水紙法的標準操作： a 用三層無菌吸水紙，吸足無菌水后，滴掉多余的水，放人經(jīng)消毒的培養(yǎng)皿內(nèi)，將種子排列在吸水紙上。 b 各粒種子間要保持一定距離，一般不得少于1-1.5cm，再將培養(yǎng)(piyng)皿置于適當溫濕度的恒溫箱培養(yǎng)(piyng)。 c 在培養(yǎng)期間，每天用12h光照和黑暗交替處理，保持一定周期。 d 作物種子和病菌一般經(jīng)2-10d培養(yǎng)，種子表面就會長出待

10、檢病菌，最后進行鏡檢。 共七十二頁優(yōu)點:設備簡單，應用范圍廣，操作方便；花費(hufi)少，快速準確，易于掌握；受檢病癥立體感強，容易鑒定和便于制作標本等。缺點:在此條件下，有些真菌的菌絲生長不旺盛和產(chǎn)孢量少，而很快被許多雜菌快速生長，超過或掩蓋被檢病菌。 吸水紙法的特點(tdin)：共七十二頁 (2)冰凍吸水法 這是一種改進的保濕培養(yǎng)法，其操作步驟如下： a 種子排列在吸水紙上，一般谷物種子在10下保持3d，使其先萌芽(mngy)。 b 20的溫度下，保持2d（其他種子在20下保持4d)。 c 再將幼苗在-20的溫度下，進行冰凍過夜，以死亡的幼苗作為培養(yǎng)基。 d 20的溫度下，用光暗交替處理

11、12h，保持5-7d。 為了防止細菌的污染，可在吸水紙上加些抗生素，如210-4金霉素或土霉素等數(shù)滴。 優(yōu)點：有利于病原(bngyun)物形成孢子，同時又避免因種子萌芽伸長后造成相互覆蓋，便于檢查。共七十二頁(3)瓊脂平皿法 此法與吸水紙法所不同之處，就是用1.5%-1.7瓊脂，經(jīng)滅菌后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成一定厚度的平面，代替吸水紙。 優(yōu)點：因含水量均勻一致(yzh)，有利于病原菌生長，皿內(nèi)潔凈，雜菌少，便于檢查，因此常用于植物檢疫檢驗。 瓊脂(qingzh)平皿法用于棉花枯、黃萎病菌的檢驗。共七十二頁 將沙用清水洗去泥垢，然后用沸水煮過，鋪在經(jīng)酒精或福爾馬林液消毒過的萌芽器內(nèi)，加冷開水至含

12、沙量的60左右。 沙面應低于容器邊緣4cm，在鋪平的沙上排列種子(zhng zi)，間隔一定距離。排好種子(zhng zi)后，再加細沙覆蓋2-3cm，并加容器蓋，置于25的溫箱中。 當?shù)谝粋€幼芽長高碰到頂蓋時，即應去蓋。經(jīng)過一定時期，將幼芽連根取出，并取出發(fā)芽的種子，根據(jù)幼苗和未發(fā)芽種子所表現(xiàn)的癥狀及種苗上有無孢子，就可計算發(fā)芽率及發(fā)病率。2沙內(nèi)萌芽(mngy)檢驗共七十二頁3土內(nèi)萌芽檢驗 將種子播種在含有滅菌土壤的盆缽或播種箱內(nèi)，保持適宜發(fā)芽的溫、濕度。待種子發(fā)芽出土(ch t)后，進行檢驗，分析其發(fā)病情形。共七十二頁4試管幼苗癥狀測定 做試管斜面，每管放人1粒種子，塞緊管口。再置于20下

13、，用人工光照(gungzho)和黑暗各半處理。當幼苗達到管頂時，即可將管蓋取掉。待培養(yǎng)期到后，檢查幼苗癥狀。保濕萌芽檢驗(jinyn)的優(yōu)點: 容易檢查根部和綠色部分，也可避免相互傳染，但操作較麻煩，一般可用于檢驗珍貴的繁殖材料。 共七十二頁保濕萌芽檢驗的缺點： 1、在對寄主生長發(fā)育不良，而適宜(shy)于病菌生長發(fā)育的條件下，則某些腐生菌可能變成萌芽階段的寄生菌，造成幼芽發(fā)生部分病斑。 2、由于主要還是依靠肉眼檢查，多種病害可以產(chǎn)生類似的病癥，就是同一種病害也可發(fā)生不同的癥狀等，這些(zhxi)情況都足以影響檢驗結(jié)果的準確性。共七十二頁 （八）分離培養(yǎng)(piyng)檢驗分離培養(yǎng)主要應用于檢驗

14、潛伏于種子、苗木或其他植物新產(chǎn)品內(nèi)部，不易發(fā)現(xiàn)和鑒定的病原菌；或當種子、苗木或其他植物產(chǎn)品上雖有病斑，但無特殊性的病原菌可供鑒定的場合。不同的病原菌，其所用的培養(yǎng)基、分離方法、培養(yǎng)條件等不盡相同，必須因病制宜地加以使用。 通過分離培養(yǎng)所得到的待檢病菌，應通過必要(byo)的步驟進行仔細鑒定。共七十二頁分離真菌的方法有： 1、組織分離法： 將樣品材料經(jīng)表面(biomin)消毒并沖洗后切成小塊，輕輕置于培養(yǎng)基平板表面(biomin)，寫好標簽后，即可培養(yǎng)觀察。 2、稀釋分離法：將寄主組織受害部位的孢子洗下配成懸浮液，經(jīng)稀釋后與熔化(rnghu)并冷卻45左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，然后倒在滅菌的培養(yǎng)基中

15、。共七十二頁 從種子、苗木及其他繁殖材料上獲得的病菌，有時還需接種到植株上，使其表現(xiàn)典型癥狀(zhngzhung)后，再檢查鑒別。（九）接種(jizhng)方法共七十二頁 由于病原種類與傳播方式不同，其接種的方法也各不相同，常用接種方法有下列(xili)幾種： (1)拌種接種：用病菌孢子拌種，是接種黑粉病（如矮腥黑穗?。┳畛Ｓ玫姆椒ā?(2）浸種接種：用病原真菌孢子懸浮液浸種，也是常用的接種方法。 (3)花期接種法：主要用于從花期侵入的病菌。如：大麥、小麥散黑穗病菌的接種。在抽穗后1-2天，用冬孢子懸浮液注射到花內(nèi)。 (4）整株噴霧接種：孢子懸浮液噴在葉片或莖部 (5)土壤接種法：針對一些土傳

16、病菌，如棉花枯、黃萎菌。 共七十二頁 核酸技術是一種DNA分析鑒定技術，其方法快速、準確，因此，在植物病原菌的分類鑒定和親緣關系分析等方面已有廣泛的應用。 核酸技術基于(jy)PCR（聚合酶鏈式反應），它是一種體外DNA擴增技術，由于其快速、準確、所需樣品量少的特點，十分符合植物檢疫檢驗過程的要求。根據(jù)不同的檢疫對象，需設計出特異性的引物，就可鑒定特定的病原菌。 （十） 核酸(h sun)技術共七十二頁(十) 隔離種植(zhngzh)檢驗 不易發(fā)現(xiàn)癥狀或病原物，需要在生長發(fā)育階段進行病害觀察或分析鑒定。 隔離種植應在溫室或極為嚴密的隔離區(qū)進行，并在各個生長發(fā)育階段進行觀察。共七十二頁對不同的病

17、害(bnghi)，用不同的方法：1.2.3.4.5.對較大(jio d)的病原體過篩肉眼對種子外表有明顯癥狀的表面帶菌但看不見的洗滌濾紙培養(yǎng)胚內(nèi)病菌離體胚培養(yǎng)種子內(nèi)部的病原菌瓊脂培養(yǎng)肉眼共七十二頁共七十二頁第二節(jié) 植物病原細菌檢疫檢驗(jinyn)技術主講(zhjing)：王曉東 副教授共七十二頁 所有已知植物細菌病害都可以通過種苗傳播，通過種子傳病的占40以上，準確(zhnqu)檢測種子和種苗是否攜帶檢疫性病原細菌，是防治這類病害的關鍵。 一、病原(bngyun)細菌的檢測共七十二頁 植物病原細菌的檢測方法，大致可分為直接檢測和間接檢測兩大類。直接檢測：檢測病原細菌時，病原物不被提取(tq)

18、或分離出來。間接檢測：先把病原細菌提取、分離或破壞以后進行檢測。 又分為活菌檢測和非活菌檢測。共七十二頁（一）直接(zhji)檢測 1.直觀檢驗 直觀檢驗是以癥狀為主的田間檢測，植物細菌病害的產(chǎn)地檢疫主要(zhyo)是以這種方式進行的。通過肉眼觀察植株的癥狀、菌膿以及鏡檢觀察，并結(jié)合田間診斷結(jié)果而做出。共七十二頁共七十二頁共七十二頁快速(kui s)診斷細菌性病害方法-細菌溢共七十二頁2. 生長檢驗 ：生長檢驗有實驗室和田間幼苗癥狀檢驗兩種。(1)實驗室檢驗：這種檢驗是將種子播種在濕潤(shrn)吸水紙上，或水瓊脂培養(yǎng)基平板上，根據(jù)幼芽和幼苗癥狀做出初步診斷。 (2)田間幼苗癥狀檢驗：此法常受

19、到環(huán)境條件的影響。 在植物檢疫中，生長檢驗多作為初步檢驗。共七十二頁（二）間接(jin ji)檢測1. 活菌檢測（1）分離(fnl)培養(yǎng)法檢驗A 分離病原細菌 一般用稀釋分離法。稀釋分離有以下兩種方法。 培養(yǎng)皿稀釋分離法 平板劃線分離法 共七十二頁培養(yǎng)皿稀釋(xsh)分離法共七十二頁平板(pngbn)劃線分離法 取小塊病組織用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移植環(huán)蘸取以上組織液在瓊膠平板上劃線培養(yǎng)；先在平板的一側(cè)順序(shnx)劃35條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60將移植環(huán)滅菌后,從第二條線末端，順序劃出3-5條線。目的都是使細菌分開形成分散的菌落。 共七十二頁傳統(tǒng)(chuntng)鑒定方法 培養(yǎng)性

20、狀觀察 培養(yǎng)性狀對細菌(xjn)的鑒定是很重要的。不同屬的植物病原細菌(xjn)，它們的培養(yǎng)性狀顯然不同。 培養(yǎng)性狀要分別在培養(yǎng)液、瓊膠斜面和瓊膠平板上觀察。描述時，要指明培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等。共七十二頁細菌(xjn)的色素非水溶性色素:水溶性色素:共七十二頁細菌(xjn)的形態(tài)革蘭氏染色法結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復染涂片固定 陽性菌紫色 陰性菌紅色(hngs)共七十二頁鞭毛(binmo)染色涂片(t pin)干燥固定染色1min水洗、吸干鏡檢制備涂片標本染色共七十二頁生理(shngl)和生物化學性狀用細菌的培養(yǎng)物接種于一些特定的培養(yǎng)基上或檢測管內(nèi)，通過產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、顏色(yns)

21、變化等反應，檢測細菌的耐性、好氧或厭氧性、對碳素、氮素和大分子化合物的利用和分解能力等，以達到鑒定的目的。共七十二頁常見(chn jin)的生化反應對糖的發(fā)酵甲基紅試驗(shyn)單糖發(fā)酵試驗對蛋白質(zhì)的發(fā)酵吲哚試驗硫化氫試驗其他試驗尿素酶試驗枸櫞酸鹽利用試驗共七十二頁目前，在傳統(tǒng)測定的基礎上，發(fā)展了測定細菌多項生理生化(shn hu)指標并且借助于計算機統(tǒng)計和決策的快速測定方法。常見的有生化測定試劑盒、Biolog測定、甲基脂肪酸氣相色譜分析法等。共七十二頁（2）濃縮(nn su)接種及離體葉檢測法把繁殖材料或種子的提取液經(jīng)濃縮(nn su)后，通過注射、針刺、摩擦、剪葉或噴霧接種等方法，接種

22、到感病植物上觀測是否發(fā)病及其癥狀特點共七十二頁（3） 噬菌體檢驗(jinyn)原理：噬菌體侵染細菌，裂解寄主細胞，在固體平板上培養(yǎng)，則出現(xiàn)噬菌斑。噬菌體具有專化性，利用此特點，可鑒別細菌的種類。噬菌體是侵染細菌的病毒，能在活細菌細胞中寄生(jshng)、繁殖，并裂解寄主細胞。共七十二頁 優(yōu)點：噬菌體法要是簡便、快速，能直接用種子提取液測定。 缺點：非目標(mbio)菌量多存在時敏感性較差，噬菌體寄生的?；院图毦鷮κ删w的抵抗性，都可能影響檢驗的準確性。共七十二頁過敏性反應(fnyng)致病性的初步測定為了確定分離到的大量菌種哪些是致病性的，用常規(guī)接種方法比較費事，有的要經(jīng)過相當長的時間。用植

23、物的過敏性反應，來快速篩選致病性細菌。方法是將濃度107/ml的細菌的懸浮液注射在煙草葉片的細胞間致病性細菌往往在6-24h內(nèi)就在注射點周圍出現(xiàn)(chxin)過敏性枯斑，而腐生性細菌則不表現(xiàn)這種反應。注射Pseudomonas屬細菌的，一般在6-10h 即出現(xiàn)枯斑，注射 Xanthomonas屬細菌的要10-24h。 煙草、蠶豆葉片也是很好的試驗材料。共七十二頁 用于植物病原細菌鑒定和檢測(jin c)的主要方法2、非活菌檢測(jin c)共七十二頁（1）免疫吸附分離(fnl)檢測法原理：結(jié)合血清學與平板分離技術，利用與抗原高度親和性的抗體，來捕獲目標細菌，樣本中其他細菌均被沖洗掉，再將目標細

24、菌轉(zhuǎn)移或釋放到培養(yǎng)基上生長(shngzhng)。方法：平皿免疫吸附評價測定法和免疫吸附稀釋培養(yǎng)法共七十二頁共七十二頁 該法可以定性、定量檢測樣品中的抗體或抗原(kngyun)，具有靈敏、簡單、快速等優(yōu)點，已被廣泛地用于植物病原細菌的檢測。 共七十二頁在這種測定方法中有3種必要(byo)的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標記的抗原或抗體（標記物）酶作用的底物（顯色劑）酶 底 物顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色 黃色棕色 蘭色藍綠色492 460449 425642堿性磷酸酯酶 4-硝

25、基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍色 405420 -半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 熒光黃色 360,450420 共七十二頁免疫熒光抗體(kngt)測定是先將熒光染料（異硫氰酸熒光黃或羅丹明等）與抗體(kngt)，以化學方法結(jié)合起來，形成標記抗體(kngt)。當與相應的抗原反應后，產(chǎn)生有熒光標記的抗體(kngt)-抗原復合物。 （2 ）免疫熒光抗體(kngt)法共七十二頁 熒光染料不影響抗體(kngt)的免疫特性，但在熒光顯微鏡下，能觀察到黃綠色熒光，熒光的存在就表示抗原的存在。共七十二頁（3）PCR技術(jsh)及其應用PCR的原理(yunl)基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段共七十二頁引物DNA聚合酶94變性(binxng)50-65退火