CD34絕對(duì)計(jì)數(shù)參考課件

1、 1 流式細(xì)胞術(shù)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù) 2概論 造血干細(xì)胞移植（HSCT）是治療血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、某些實(shí)體瘤和基因缺陷等疾病的重要手段之一。在造血干細(xì)胞移植過(guò)程中采集足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞是造血干細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵。 3概論 但至今為止，尚無(wú)一個(gè)與體內(nèi)重建造血全吻合的造血干細(xì)胞體外檢測(cè)法。 早期通過(guò)有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成單位來(lái)計(jì)算移植物中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量，但前者與造血干細(xì)胞數(shù)量一致性差，后者實(shí)驗(yàn)變異性大、耗時(shí)長(zhǎng)，其臨床使用價(jià)值低。 4概論 20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)CD34分子在造血干/祖細(xì)胞上表達(dá)，為臨床HSCT提供了可評(píng)價(jià)造血干/祖細(xì)胞植入最低閾值的強(qiáng)有力的依據(jù)。 5概論 近年來(lái)盡管體

2、外研究表明，人類CD34-臍血干細(xì)胞也有造血活性，但大量的臨床研究證實(shí)用富含CD34+細(xì)胞移植可安全、持久地重建多系造血。因此，目前臨床及實(shí)驗(yàn)室仍然是應(yīng)用CD34+細(xì)胞進(jìn)行造血干細(xì)胞移植、基因轉(zhuǎn)染等。 6概論 而流式細(xì)胞儀具有CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確、方便、快捷等優(yōu)勢(shì)，已廣泛地應(yīng)用于造血干/祖細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)及采集時(shí)機(jī)的確定。 7造血干細(xì)胞的數(shù)量是造血干細(xì)胞移植 成功的關(guān)鍵因素造血干細(xì)胞移植造血干細(xì)胞的數(shù)量惡性血液病某些實(shí)體瘤免疫性疾病免疫缺陷病心肌血管胰島細(xì)胞成功的關(guān)鍵 8 如何準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞的數(shù)量，什么是有效的質(zhì)量控制成了各大實(shí)驗(yàn)室探討的焦點(diǎn)。 常用的方法： 集落培養(yǎng)法 流式細(xì)胞術(shù)CD3

3、4+細(xì)胞計(jì)數(shù)法造血干細(xì)胞的檢測(cè)方法 9集落培養(yǎng)法：優(yōu)點(diǎn)：干細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與移植結(jié)果相吻合缺點(diǎn)：很難標(biāo)準(zhǔn)化，只代表晚期干/祖細(xì) 胞，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，不能當(dāng)即判斷采 集物的造血干細(xì)胞數(shù)量。 10流式細(xì)胞術(shù)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)法：優(yōu)點(diǎn)：干細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與移植結(jié)果相吻合 快速，簡(jiǎn)單，方便。 目前已取代了集落培養(yǎng)法 11標(biāo)本標(biāo)識(shí) 造血干細(xì)胞采集完成后立即抽樣，抽樣前要將采集袋中的細(xì)胞與小辮中的采集物混合5次以上，再封閉小辮，剪取小辮中的采集物，在小辮上標(biāo)記供者編號(hào)、姓名及標(biāo)本名稱，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。 12 標(biāo)本標(biāo)識(shí) 所有檢測(cè)標(biāo)本應(yīng)及時(shí)貼上標(biāo)簽，注明 患者姓名，標(biāo)本類型，采集時(shí)間，申請(qǐng)單和標(biāo)本粘貼在一起送檢，申請(qǐng)單要詳

4、細(xì)填寫患者的信息、標(biāo)本類型及檢測(cè)項(xiàng)目，進(jìn)行雙平臺(tái)檢測(cè)時(shí)還需提供白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。 13 抗凝劑的選擇 不同的抗凝劑抗凝、標(biāo)本的穩(wěn)定性不同。EDTA抗凝的標(biāo)本，常溫下可保存12-24h，肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝的標(biāo)本可保存48h。 如果標(biāo)本需用血細(xì)胞分析儀同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，則應(yīng)選擇EDTA抗凝。 14抗凝劑的選擇 1、外周血標(biāo)本常選用EDTA鹽抗凝，2、采集物常用枸櫞酸鈉凝， 3、骨髓和臍血標(biāo)本可選用EDTA、 肝素或ACD 抗凝。 15標(biāo)本質(zhì)量 標(biāo)本處理的步驟越多，細(xì)胞丟失就越多。對(duì)于全血標(biāo)本，溶血后不洗滌，可以使標(biāo)本處理的步驟減到最少，細(xì)胞丟失少。 16 標(biāo)本質(zhì)量 （標(biāo)本目測(cè)） 標(biāo)本常見

5、問題有兩種類型： 1 、變性或損壞的標(biāo)本，需立即棄之； 2、標(biāo)本在處理過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤操作，則 需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。錯(cuò)誤操作問題需要記錄下來(lái)，這對(duì)標(biāo)本的處理、分析以及結(jié)果地解釋將很有幫助。 17標(biāo)本質(zhì)量 （溶血、凝血） 1、嚴(yán)重溶血的標(biāo)本應(yīng)該放棄檢測(cè)。所 有可能破壞標(biāo)本完整性的異常情況均應(yīng)密切觀察，并記錄下來(lái)。 2、即使很小的凝塊也會(huì)引起血液中某些成分的選擇性丟失或改變，凝血的標(biāo)本應(yīng)盡可能棄用。 18標(biāo)本質(zhì)量（溫度極限） 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)送的標(biāo)本，應(yīng)確認(rèn)標(biāo)本是否過(guò)熱或過(guò)冷，即使其他所有的鑒定標(biāo)準(zhǔn)都正常，也應(yīng)該記錄下來(lái)以利于后續(xù)的處理、分析和結(jié)果解釋。 19標(biāo)本質(zhì)量（錯(cuò)誤標(biāo)本） 如果標(biāo)本沒有標(biāo)簽或標(biāo)

6、簽與病人信息不符，應(yīng)拒絕接收標(biāo)本，并及時(shí)與相關(guān)醫(yī)護(hù)人員溝通 20標(biāo)本質(zhì)量（標(biāo)本保存時(shí)間及條件） 可接受的標(biāo)本最長(zhǎng)保存時(shí)間取決于抗凝劑的種類、溶血?jiǎng)?chǔ)存條件及細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)使用的抗凝劑和溶血?jiǎng)┐_定可接受的標(biāo)本最長(zhǎng)保存時(shí)間。 21標(biāo)本質(zhì)量（標(biāo)本保存時(shí)間及條件） 原則上標(biāo)本采集后應(yīng)立即檢測(cè)，但是實(shí)際操作中往往無(wú)法做到。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)該保存于2-6冰箱中。標(biāo)本的處理和免疫染色應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。 22標(biāo)本運(yùn)送 采集標(biāo)本應(yīng)該在2-6環(huán)境下盡快送檢，注意避免標(biāo)本凍結(jié)和過(guò)熱。 內(nèi)部送檢可用具有防漏密封的塑料袋和帶蓋的塑料容器等運(yùn)送標(biāo)本。 23標(biāo)本運(yùn)送 外部運(yùn)送標(biāo)本，包裝要求含有三層體

7、系：防水內(nèi)容器；防水并含有吸附材料的第二層內(nèi)容器；堅(jiān)固的外包裝。致病原血液標(biāo)本應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定運(yùn)送。 24CD34+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)方法 25CD34+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)方法 CD34+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)分為單平臺(tái)方法和雙平臺(tái)方法。單平臺(tái)方法是首選方法，它避免了室間變異和多臺(tái)儀器間的系統(tǒng)誤差。 26單平臺(tái)計(jì)數(shù)單平臺(tái)：在抗體染色的細(xì)胞中,等容量加入確定濃度的熒光微球，直接用FCM檢測(cè)出采集物中的CD34+濃度，然后計(jì)算出采集物中的CD34+細(xì)胞總數(shù) 27 通過(guò)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或使用血細(xì)胞分析儀預(yù)先計(jì)算標(biāo)本中的白細(xì)胞濃度，并嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書調(diào)整標(biāo)本和抗體的最佳比例。白細(xì)胞濃度和抗體用量 28 白細(xì)胞過(guò)少的標(biāo)本應(yīng)減少

8、單抗用量；白細(xì)胞過(guò)多的標(biāo)本應(yīng)使用含1%白蛋白或其他蛋白的PBS稀釋到適當(dāng)濃度。白細(xì)胞濃度和抗體用量 29 標(biāo)本和熒光微球的移液量應(yīng)精確，確保準(zhǔn)確計(jì)數(shù)加入的定量微球的濃度和標(biāo)本體積，推薦采用反向抽吸法加樣。移液量 30 裂解時(shí)間和方法按照所用溶血素說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用含7-AAD方案時(shí)應(yīng)選擇不含固定劑的溶血素，如氯化銨-Tris緩沖液。裂解紅細(xì)胞 31 為避免熒光微球的丟失，單平臺(tái)計(jì)數(shù)在裂解紅細(xì)胞后不用離心洗滌。離心 32雙平臺(tái)方法雙平臺(tái)：分別用FCM檢測(cè)出CD34+細(xì)胞在有核細(xì)胞中的比例，用血液細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)出有核細(xì)胞濃度，在光鏡下進(jìn)行白細(xì)胞分類，然后再計(jì)算出采集物中CD34+細(xì)胞總數(shù)。 33

9、雙平臺(tái)方法 白細(xì)胞濃度與抗體用量同單平臺(tái)方法，不需要采用已知數(shù)量的熒光微球管或加入熒光微球懸液。裂解紅細(xì)胞的時(shí)間和方法按照所用溶血素說(shuō)明書進(jìn)行，裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行離心洗滌2次。 34免疫熒光染色 可采用商品化CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒或?qū)嶒?yàn)室自己組合的單抗。 35免疫熒光染色 自己組合的抗體中,每一種抗體都需分別滴定,以明確其噪音與陽(yáng)性信號(hào)的最佳分離滴度，并檢測(cè)作為組合抗體使用和作為組合抗體成分之一單獨(dú)使用的平均熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率，其可比性需要在均值2標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)。 36抗體及熒光微球的選擇CD34抗體：選擇PE直標(biāo)的抗類抗體；CD45抗體：選擇廣譜的抗CD45抗體；CD34抗體同型對(duì)照：采用與CD3

10、4匹配的同一 廠家生產(chǎn)的同型對(duì)照；定量熒光微球：推薦使用絕對(duì)計(jì)數(shù)的商品化熒光微球。 37抗體組合方案含7-氨基放線菌素D（AAD）的三色方案：抗體組合為CD45，CD34，7-AAD；不含7-AAD的雙色方案：抗體組合為CD45，CD34。 38免疫熒光染色按照試劑說(shuō)明書和注意事項(xiàng)進(jìn)行操作，一般流程如下： 39 取含1106白細(xì)胞的全血或稀釋的標(biāo)本50L-200L加入適量直標(biāo)抗體10L-20L，室溫孵育20min-30min。標(biāo)本與抗體孵育 40 裂解時(shí)間和方法按照所用溶血素說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用含7-AAD方案時(shí)應(yīng)選擇不含固定劑的溶血素，如氯化銨-Tris緩沖液。裂解紅細(xì)胞 41 離心洗滌方法

11、與溶血素有關(guān)，按照所用溶血素說(shuō)明書進(jìn)行操作。單平臺(tái)絕對(duì)值計(jì)數(shù)法在裂解紅細(xì)胞后，不要離心洗滌離心 42 采用包被有已知數(shù)量的熒光微球或按說(shuō)明書加入一定數(shù)量的熒光微球。絕對(duì)計(jì)數(shù)的商品化熒光微球 43 制備好的標(biāo)本在上機(jī)分析前放在4-10下避光保存，應(yīng)在1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)前混勻細(xì)胞。染色后標(biāo)本保存 44對(duì)照通常采用同型對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本同型對(duì)照：采用ISHAGE設(shè)門方法時(shí)可不需同型對(duì)照，多重邏輯設(shè)門后可去除非特異性抗體結(jié)合；對(duì)照標(biāo)本 45 陽(yáng)性對(duì)照：檢測(cè)新批號(hào)和當(dāng)前批號(hào)試劑的染色效率是否有問題時(shí)需要做陽(yáng)性對(duì)照，或懷疑試劑出現(xiàn)問題時(shí)，采用該試劑與已知可接受性能批號(hào)的試劑同時(shí)操作進(jìn)行驗(yàn)證。 對(duì)照標(biāo)本

12、46陽(yáng)性對(duì)照的種類：主要有全血標(biāo)本，凍干淋巴細(xì)胞；使用頻率：更換試劑時(shí)對(duì)照標(biāo)本 47流式細(xì)胞儀的質(zhì)控 包括光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整、熒光分辨率的調(diào)整、熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)整、性能評(píng)估及比例、儀器保養(yǎng)及記錄等。儀器的調(diào)整很多方面要遵從制造商的建議。 48數(shù)據(jù)的獲取和分析 49細(xì)胞的獲取 設(shè)定閾值和分辨率：根據(jù)儀器操 作說(shuō)明書和試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn) 行設(shè)定。 調(diào)整細(xì)胞群分布：在CD45/SSC散 點(diǎn)圖中，調(diào)整SSC，使所有的白細(xì) 胞群均可見。 50 作CD45/SSC散點(diǎn)圖定位白細(xì)胞群，排除標(biāo)本中細(xì)胞碎片等對(duì)計(jì)數(shù)的干擾； CD45從強(qiáng)陽(yáng)性到弱陽(yáng)性，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、原始細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和有核紅細(xì)胞。根

13、據(jù)CD45劃定白細(xì)胞區(qū)域 51 在非設(shè)門熒光散點(diǎn)圖中，至少收集50000個(gè)白細(xì)胞及100個(gè)CD34+細(xì)胞。采集細(xì)胞數(shù) 52CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù) 53雙參數(shù)熒光散點(diǎn)圖的設(shè)置 雙平臺(tái)雙色CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)置： CD45/SSC、CD34/SSC、 CD45/SSC、 FSC/SSC、CD45/CD34、FSC/SSC 6個(gè)散點(diǎn)圖。 54雙參數(shù)熒光散點(diǎn)圖的設(shè)置 單平臺(tái)三色CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)置：CD45/SSC、CD34/SSC、 CD45/SSC、FSC/SSC，CD45/CD34、FSC/SSC、7-AAD/SSC、7-AAD/SSC 8個(gè)散點(diǎn)圖。 55設(shè)門方法 56雙平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 白細(xì)

14、胞計(jì)數(shù)需要與CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)使用同一標(biāo)本檢測(cè)，并在6h內(nèi)完成。當(dāng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)不能準(zhǔn)確獲得時(shí)，不能用雙平臺(tái)方法，只能用單平臺(tái)方法。 57基本的ISHAGE：雙平臺(tái)法試劑：CD45-FITC,CD34-PE全血，直接熒光標(biāo)記，溶血、洗滌、雙平臺(tái)設(shè)門CD45/SSC,CD34/SSC, FSC/SSC，CD45/CD34河南省人民醫(yī)院血研所5858 59標(biāo)記定義G1R1G2R1 and R2G3R1 and R2 and R3CD34+細(xì)胞R1 and R2 and R3 and R4淋巴細(xì)胞R5雙平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 60(1)CD45/SS R1包括所有CD45+及dimCD45。R5為淋巴細(xì)胞

15、(2)CD34/SS。顯示R1門內(nèi)細(xì)胞。R2包括所有CD34+細(xì)胞，從低SS到中等SS強(qiáng)度。雙平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 61(3)CD45/SS。顯示R1+R2門內(nèi)細(xì)胞。R3確認(rèn)CD34+細(xì)胞位于低CD45與低SS區(qū)域，為真正CD34+細(xì)胞。雙平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 62(4)FS/SS，取R1+R2+R3門內(nèi)細(xì)胞。R4選取SS大于淋巴細(xì)胞下限的細(xì)胞，用于去除細(xì)胞碎片、聚集血小板的影響。雙平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 63(5)CD45/CD34。顯示R1門內(nèi)細(xì)胞，設(shè)定CD45和CD34陽(yáng)性十字界線，確定R1的左邊界CD45下限。(6)FS/SS。顯示R5門內(nèi)細(xì)胞，用于確定R4的FS下限。雙平臺(tái)ISHAGE

16、設(shè)門 64單平臺(tái)ISHAGE設(shè)門法 商業(yè)化的CD34+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)試劑盒,其CD34+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由專門軟件直接計(jì)算生成，操作依據(jù)是試劑操作說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)室自己配制的抗體組合需要加入商業(yè)化熒光微球。 65 66 同雙平臺(tái)相比，單平臺(tái)多設(shè)了R6（熒光微球）、R7（細(xì)胞碎片）及R8（活的CD34+細(xì)胞）。單平臺(tái)ISHAGE設(shè)門 67單平臺(tái)ISHAGE設(shè)門法 需手動(dòng)設(shè)門，對(duì)操作者要求高；無(wú)需同型對(duì)照，亦不受抗體濃度及熒光素與蛋白比率的限制，經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，抗體的選擇范圍也寬；7-AAD活細(xì)胞染料，可計(jì)數(shù)活細(xì)胞，需邏輯手動(dòng)設(shè)門。 68結(jié)果報(bào)告和審核 69報(bào)告內(nèi)容雙平臺(tái)ISHAGE法報(bào)告CD34+細(xì)胞百分比及絕對(duì)

17、值；單平臺(tái)ISHAGE法報(bào)告CD45+細(xì)胞絕對(duì)值、CD34+細(xì)胞百分比及絕對(duì)值、活CD45+細(xì)胞和CD34+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。 70審核內(nèi)容 包括數(shù)據(jù)采集閾值的設(shè)置、采集細(xì)胞數(shù)和微粒數(shù)、散射光模式、抗體組合方案、與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)的所有設(shè)門等。這些數(shù)據(jù)均由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員在解釋數(shù)據(jù)時(shí)進(jìn)行審核。 71參考范圍 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)確定本實(shí)驗(yàn)室CD34+細(xì)胞在外周血、動(dòng)員后的外周血、采集物、骨髓和臍帶血中的參考范圍。 72數(shù)據(jù)儲(chǔ)存 數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和檢測(cè)數(shù)據(jù)的方法都應(yīng)詳細(xì)記錄，以便于檢測(cè)者或醫(yī)師對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)核。保留報(bào)告原始數(shù)據(jù)至少2年。 73室內(nèi)質(zhì)控 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開展室內(nèi)控制工作，建議每月至少進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控一次。進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)前，首先采用健康志愿者的新鮮外周血標(biāo)本作為質(zhì)控物上機(jī)測(cè)定，一般需要做重復(fù)測(cè)定。 74室間質(zhì)控 實(shí)驗(yàn)室