自身免疫病與自身抗體的檢測(cè)

1、自身免疫病與自身抗體的檢測(cè)免疫 機(jī)體識(shí)別和排除抗原性異物的功能，也就是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過(guò)程。 抗原性異物： 引起過(guò)敏反應(yīng)：花粉、食物和藥物; 病原微生物及其毒性產(chǎn)物; 衰老退變的細(xì)胞及偶爾出現(xiàn)的癌變細(xì)胞。 有利：通過(guò)對(duì)這些抗原性異物的識(shí)別和清 除，機(jī)體才能保持相對(duì)的自身穩(wěn)定。 不利：免疫識(shí)別也可針對(duì)自身成分，引起超敏反應(yīng)和自身免疫病等。免疫保護(hù)：一般情況下，免疫應(yīng)答的結(jié)果是產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞， 具有抗感染、抗腫瘤等對(duì)機(jī)體有利的效果。免疫耐受現(xiàn)象 天然耐受：1945年OWEN發(fā)現(xiàn)異卵雙生的兩只小牛雖然自體內(nèi)的紅細(xì)胞血型不同、抗原性不同，但在對(duì)方體內(nèi)卻不引起

2、免疫反應(yīng)。 胚胎期接受異型抗原刺激免疫耐受； 宿主淋巴細(xì)胞有識(shí)別“自己”與“非已”的能力。誘導(dǎo)免疫 1953年Billingham等人企圖證明是否機(jī)體在免疫成熟前引入異物可作為“自己”成分加以識(shí)別； 用遺傳不同的純系小白鼠的淋巴細(xì)胞注入另一純系胚胎鼠內(nèi)，在出生后發(fā)育為成體時(shí)，可接受供體的皮膚移植，而不產(chǎn)生移植排斥反應(yīng)。隱蔽抗原：機(jī)體有些組織成分由于解剖位置的特殊性，正常情況下終生不與免疫系統(tǒng)接觸，稱為隱蔽抗原。例如：眼晶狀體、葡萄膜和精子等都是隱蔽抗原。機(jī)體不能建立對(duì)這些組織的免疫耐受性。出生后，由于感染或外傷等原因，隱蔽抗原被釋放出來(lái)，與免疫系統(tǒng)接觸便能誘導(dǎo)相應(yīng)的自身免疫應(yīng)答，而導(dǎo)致自身免疫

3、病的發(fā)生。如交感性眼炎等。自身免疫：是指機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞的現(xiàn)象。 自身免疫發(fā)生的原因： 1、機(jī)體抗原特異性淋巴細(xì)胞發(fā)生異常，對(duì)正常組織發(fā)生免疫應(yīng)答狀態(tài)； 2、 機(jī)體自身組織成分發(fā)生改變從而引起的免疫應(yīng)答狀態(tài)。自身免疫?。?是指在各種內(nèi)外因素的作用下，自身免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，超過(guò)了生理性自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)度且持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，造成對(duì)正常細(xì)胞、器官的功能與結(jié)構(gòu)的破壞，呈現(xiàn)與此損傷相關(guān)的臨床表現(xiàn)及免疫學(xué)異常。 微弱的自身免疫并不引起機(jī)體的病理性損傷，在許多正常人血清中可發(fā)現(xiàn)多種微量的自身抗體或致敏淋巴細(xì)胞，但在嚴(yán)格的限制范圍內(nèi)（免疫自穩(wěn)），這種自身免疫現(xiàn)象隨

4、著年齡遞增而愈加明顯，在70%以上的正常老年人血清中可查出自身抗體，這些低滴度的自身抗體能促進(jìn)體內(nèi)衰老蛻變的自身成分（自身抗原）的消除，以執(zhí)行免疫穩(wěn)定與免疫監(jiān)視的任務(wù)，所以說(shuō)：自身免疫反應(yīng)是免疫系統(tǒng)正常生理功能的重要組成部分。自身免疫病的基本特征自身免疫病的病因不祥，有些自身免疫病的發(fā)生和復(fù)發(fā)似與某些外因有關(guān)，但大多數(shù)自身免疫病似乎是“自發(fā)”地發(fā)生的，致少目前未找到肯定的有關(guān)外因。自身抗體和血液中可檢出高滴度的（或）與自身組織成分起反應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞?；颊呓M織器官的病理特征為免疫炎癥，并且損傷的范圍與自身抗體或致敏淋巴細(xì)胞所針對(duì)的抗原分布相對(duì)應(yīng)。 1、器官特異性自身免疫?。喝鐦虮臼霞谞钕傺祝?/p>

5、液中可檢出高滴度的抗甲狀腺球蛋白抗體-只損傷患者甲狀腺。 2、非器官特異性自身免疫?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），血液中可檢出多種自身抗體，損傷并非局限于某一器官系統(tǒng)，病理?yè)p傷廣泛。自身免疫病的發(fā)生與多因素相關(guān)，包括遺傳因素、性別差異、年齡大小、氣候環(huán)境及地理位置等。遺傳因素： 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者90%為HLA-B27陽(yáng)性，然而在HLA-B27陽(yáng)性的人群中發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的可能僅為2%，而第一級(jí)HLA-B27陽(yáng)性的親屬中，發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的危險(xiǎn)性達(dá)20%。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的家族發(fā)病率也較高，在SLE第一代親屬中發(fā)病率達(dá)3%-5%，同胞姐妹發(fā)病率更高，特別是單卵雙胎更為常見(jiàn) 。在

6、1980年的調(diào)查中35組單卵雙胎的患者中，有22組患SLE，共患病率達(dá)62.9%，而雙卵雙胎8組中僅1組患病，為12.5%。性別差異和年齡大?。?強(qiáng)直性脊柱炎（AS）多見(jiàn)于年輕男性，其發(fā)病年齡從4-90歲不等，但以15-20歲多見(jiàn)，男女比列為9-10:1，但最近有人調(diào)查發(fā)現(xiàn)男女比列約為1.5-3:1，只不過(guò)女性 強(qiáng)直性脊柱炎患者起病緩慢，病情較輕，易被誤診。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是最常見(jiàn)的自身免疫性疾病之一，發(fā)病的男女比列為1:9，在生肓年齡甚至可高達(dá)1:30，而且多發(fā)生于20-40歲的孕齡婦女。 許多患者因妊娠或分娩發(fā)病、加重,這就提示了內(nèi)分泌對(duì)病情影響至關(guān)重要，妊娠期婦女由于內(nèi)分泌發(fā)生

7、變化，雌激素水平升高，導(dǎo)致CD4細(xì)胞（T輔助細(xì)胞）功能增強(qiáng)，CD8細(xì)胞（T抑制細(xì)胞）功能減弱，有利于引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體。氣候環(huán)境及地理位置： 自身免疫性疾病與氣候環(huán)境、地理位置及種族等有關(guān)，以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）為例，其在美國(guó)黑人的發(fā)病率是白人的3倍，但非洲黑人SLE的患病率并不高，中國(guó)人患病率也明顯高于其它東方國(guó)家與西方人，這就提示了SLE的發(fā)病有種族遺傳性。SLE在不同種族中的發(fā)病率國(guó) 籍 發(fā) 病 率（/10萬(wàn)人） 芬 蘭 28.0 印第安 16.0自身免疫病在血清學(xué)檢查時(shí)呈現(xiàn)交叉重疊現(xiàn)象： 如：橋本氏甲狀腺炎患者血清中不僅有高滴度的抗甲狀球蛋白抗體，同時(shí)?？蓹z出抗胃壁細(xì)胞抗體，且

8、甲狀腺炎的患者患自身免疫性惡性貧血癥的機(jī)會(huì)也較正常人高得多。反之，患胃的自身免疫?。ㄗ陨砻庖咝晕s性胃炎）而致惡性貧血癥的患者中，部分人有抗甲狀腺球蛋白抗體，而且他們患自身免疫性甲狀腺炎的機(jī)會(huì)也確實(shí)比正常人高得多。大多數(shù)自身免疫病呈現(xiàn)出發(fā)作緩解復(fù)發(fā)緩解遷延的臨床特征，以致成為終身痼疾。 如：SLE是一種慢性、全身性疾病，病變往往是癥狀加重與緩解交替出現(xiàn)，緩解可持續(xù)多年，但常因感染、感冒、陽(yáng)光暴曬、酗灑、過(guò)度勞累、妊娠等因素導(dǎo)致疾病發(fā)作。少數(shù)病人因激素使用不當(dāng)，撒藥過(guò)快或突然停藥引起復(fù)發(fā)，疾病每發(fā)作一次，受累的器官，特別是腎臟的損傷就加重一次，最后可導(dǎo)致腎功能不全、腎衰而死亡。免疫抑制劑（腎上腺

9、皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺）治療有一定療效，但副作用與不良反應(yīng)嚴(yán)重，停藥后常易復(fù)發(fā)。SLE的預(yù)后以下列因素有關(guān)： 發(fā)病經(jīng)過(guò)、內(nèi)臟損傷的類型與程度、診斷與治療的早晚、治療措施是否正確、有無(wú)合并癥、發(fā)病的年齡、性別、妊娠及患者的自我保護(hù)意識(shí)、配合治療等密切相關(guān)。在60年代以前，SLE患者2年死亡率為50%以上，5年死亡率達(dá)90%以上。主要死亡原因依次為腎功能衰竭、繼發(fā)感染、心肺病變、血液系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，早期診斷率得到了很大的提高，治療有力、得當(dāng)，SLE的預(yù)后有了很大的改觀，10年存活率達(dá)85%以上，病程最長(zhǎng)的已達(dá)50多年。自身免疫病的分類按疾病累及的系統(tǒng)區(qū)

10、分：結(jié)締組織疾?。喝纾篠LE、RA等。消化系統(tǒng)疾病：如：自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎（AIH）、 PBC等。生殖系統(tǒng)疾?。喝纾毫?xí)慣性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜異位癥等。神經(jīng)肌肉疾?。喝纾喝参锷窠?jīng)功能不全、重癥肌無(wú)力等。泌尿系統(tǒng)疾病：如：腎小球基底膜腎炎、原發(fā)性IgG腎病等。內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。喝纾?型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎等。血液系統(tǒng)疾?。喝纾鹤陨砻庖咝匀苎载氀⒃l(fā)性血小板 減少性紫癜等。心血管系統(tǒng)疾?。喝纾猴L(fēng)濕熱、病毒性心肌炎與心肌病等。呼吸系統(tǒng)疾病：如：特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化等。五官科相關(guān)疾病：如：交感性眼炎、晶體過(guò)敏性葡萄膜炎等。皮膚組織疾?。喝纾簩こＬ彀挴?、類天皰瘡等。按抗原成分的分布范圍分：器官特異性

11、自身免疫?。ň窒扌宰陨砻庖卟。?其自身抗原常為某一器官的特定成分，所產(chǎn)生的自身抗體或/和致敏淋巴細(xì)胞也主要是針對(duì)此特定的自身組織，病變范圍嚴(yán)格限制在該器官及所及的范圍。如：1型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎等。器官非特異性自身免疫?。ㄏ到y(tǒng)性自身免疫?。?其自身抗原則為細(xì)胞核或細(xì)胞漿成分，如組蛋白或線粒體等，病變可侵犯全身各器官系統(tǒng)，損傷并非局限于某一器官系統(tǒng)，病理?yè)p傷廣泛，體內(nèi)有多種自身抗體，其中有些自身抗體可與所有細(xì)胞核成分（如DNA）起反應(yīng)。如：SLE。中間型的自身免疫病 實(shí)際上，在器官特異性自身免疫病與器官非特異性自身免疫病之間，還存在一些中間型的自身免疫病，如原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）就極為

12、典型。本病的小膽管是免疫損傷的主要靶器官，但血液中的自身抗體(AMA)卻不只對(duì)肝臟具有特異性，而是能攻擊所有細(xì)胞的線粒體自身免疫病按其發(fā)病時(shí)有無(wú)誘因可分：原發(fā)性自身免疫病（特發(fā)性自身免疫?。?這類疾病的發(fā)生很難找到明確具體的環(huán)境因素，是自身免疫病的主體。繼發(fā)性自身免疫病 這類疾病的發(fā)生常有比較明確具體的原因，如外傷后交感性眼炎，外傷后睪丸炎所致的男性不肓癥等。 自身抗體的檢測(cè) 自身抗體：是指抗自身細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞表面和細(xì)胞外抗原的免疫球蛋白。 自身抗體是自身免疫病的重要標(biāo)記，每種自身免疫病都伴有特征性的自身抗體譜，某些自身抗體因?qū)膊〉脑\斷具有高度的特異性，已成為診斷某些疾病的血清標(biāo)記抗體或特異性

13、抗體，某些自身抗體與疾病的活動(dòng)性有相關(guān)性，個(gè)別的自身抗體被證實(shí)參與了組織的免疫病理?yè)p傷。 自身抗體檢測(cè)的臨床意義有助于自身免疫病的早期診斷；有助于判斷疾病的活動(dòng)性和預(yù)后，觀察治療反應(yīng)，指導(dǎo)臨床用藥；有助于進(jìn)一步研究和闡明自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。自身抗體的檢測(cè)方法免疫熒光標(biāo)記法：原理：將抗體（免疫球蛋白）或抗原與熒光素結(jié)合，而不失其抗體（或抗原）活性，成為具有特異性的熒光抗體（或抗原）試劑。當(dāng)浸染標(biāo)本中含有特異性的抗原（或抗體）時(shí)，就會(huì)在抗原和抗體結(jié)合部位發(fā)出亮綠色熒光。依其熒光強(qiáng)度制定加號(hào)，陰性則無(wú)特異熒光。直接熒光染色技術(shù)（DIF）原理：熒光標(biāo)記抗原或抗體，直接與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，則抗原

14、和抗體結(jié)合部位發(fā)出亮綠色熒光，為特異性結(jié)合。方法特點(diǎn)：免疫熒光直接法，特異性強(qiáng)；只能檢測(cè)一種抗原或抗體；適用于細(xì)菌抗原和病毒抗原檢查；間接熒光染色技術(shù)（IIF）原理：病人血清中的抗體與基質(zhì)片中的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再加熒光標(biāo)記的抗體，則熒光標(biāo)記抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合發(fā)出亮綠色熒光?；|(zhì)片+病人血清-抗原抗體復(fù)合物+熒(抗原） （抗體）光標(biāo)記的抗體-抗原抗體復(fù)合物-熒光標(biāo)記的抗體方法特點(diǎn)： 既可定位和鑒定抗原，還可測(cè)未知抗體，這就擴(kuò)大了免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用范圍。 熒光標(biāo)記抗體可以示蹤抗原和抗體結(jié)合位置，顯示了方法的敏感性，因?yàn)橐粋€(gè)抗原單位可以結(jié)合很多抗體單位，如果每個(gè)抗原單位可結(jié)合5個(gè)

15、抗體單位，而每個(gè)抗體單位又可結(jié)合5個(gè)熒光抗體單位的話，則細(xì)胞內(nèi)的抗原是以25倍的熒光物質(zhì)顯示出來(lái)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA）間接法測(cè)抗體原理：用純化的抗原包被微孔板，檢測(cè)相應(yīng)的抗體。放射免疫法(RIA）原理：病人血清中的抗體（或抗原）與同位素標(biāo)記的抗原（或抗體）結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，測(cè)量結(jié)合或游離的同位素的放射性，即標(biāo)志血清中抗體或抗原的濃度。金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法原理：斑點(diǎn)反應(yīng)板上固相純化抗原與血清中抗體形成復(fù)合物，膠體金標(biāo)記抗人IgG單抗與復(fù)合物結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的紅色圓斑點(diǎn)。本法用于快速檢測(cè)血清中抗體。免疫印跡法(IB）原理：以ENA分型為例，用SOS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將ENA按分子量

16、大小予以分離，再將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜，如果受檢血清含有相應(yīng)抗原的自身抗體，則在相應(yīng)位置會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，再加酶標(biāo)抗體，底物，顯色液和終止液，在抗原抗體反應(yīng)的位置出現(xiàn)顯色帶，與標(biāo)準(zhǔn)帶相比較。顆粒凝集法(PA）原理：以檢測(cè)抗脫氧核糖核蛋白體（抗DNP抗體）為例。從小牛胸腺中提取脫氧核糖核蛋白(DNP）抗原，致敏聚苯乙烯乳膠，制成抗DNP抗體乳膠凝集試劑，當(dāng)血清中存在抗DNP抗體時(shí)，便與乳膠顆粒上的DNP抗原結(jié)合，使乳膠顆粒相互凝集出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒。對(duì)流免疫電泳法(CIE）原理：對(duì)流免疫電泳又名免疫電滲電泳，實(shí)際上是加速免疫擴(kuò)散技術(shù)。因抗原大多數(shù)是屬蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，在堿性溶液

17、中帶負(fù)電荷，因此在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)。而抗體大部分屬I(mǎi)gG，分子量大，泳動(dòng)較慢，在堿性溶液中不帶電荷或帶少量負(fù)電荷。同時(shí)由于瓊脂的電滲作用，在電泳中使抗體由正極向負(fù)極移動(dòng)。這樣使抗原和抗體定向?qū)α?，兩者相遇后，在比例合適處形成可見(jiàn)沉淀線。免疫雙擴(kuò)散(DID or ID） 原理：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可以作出抗體的檢測(cè)。免疫沉淀法(RIP）斑點(diǎn)酶免疫滲透試驗(yàn)(DIEFA）斑點(diǎn)酶免疫結(jié)合試驗(yàn)(DIGFA)風(fēng)濕免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查一般臨床檢驗(yàn)常規(guī)檢查血常規(guī)RA：80%貧血，活動(dòng)期PLT升高。SLE：WBC，P

18、LT，Hb均可能降底。免疫血管炎：WBC增高。對(duì)藥物骨髓抑制的監(jiān)測(cè)。尿常規(guī)SLE：尿蛋白及RBC表明腎損傷。生化常規(guī)檢查肝功能：如有異常，應(yīng)鑒別是何種性質(zhì)（自身免疫肝病？）腎功能：免疫腎?。⊿LE？血管炎？）肌酶：多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/DM）尿酸：痛風(fēng)？免疫血清學(xué)檢查免疫球蛋白、血清蛋白電泳（高球蛋的血癥）。ESR、CRP（急性期蛋白）：對(duì)病情活動(dòng)性的判斷。CH50、C3、C4：SLE活動(dòng)期均降底。ASO：鏈球菌感染，風(fēng)濕熱。自身抗體的常規(guī)檢查病原感染常規(guī)檢查肝炎病毒：HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGVEBV,TB抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè) 抗核抗體(ANA）是自身抗體中的一

19、組抗體。ANA的研究，從發(fā)現(xiàn)狼瘡(LE）細(xì)胞算起，迄今40多年來(lái)，人們對(duì)ANA的認(rèn)識(shí)不斷加深，已衍生出具有不同臨床意義的二十余種ANA，形成了抗核抗體譜(ANAS）。這些抗體對(duì)風(fēng)濕性疾病，尤其是結(jié)締組織病的診斷，鑒別診斷和臨床治療有重要幫助?？购丝贵w：傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱?，F(xiàn)代主義：是指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱。 對(duì)ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸和核蛋白。靶抗原分布： 細(xì)胞核 細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分裂周期抗核抗體的分類：根據(jù)細(xì)胞內(nèi)靶抗原分子的理化特性核分布部位，將ANA分為： 抗DNA 抗體(anti-ds- DNA, an

20、ti-ss- DNA 抗組蛋白抗體 （ihistons：,H1,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B復(fù)合物 ） 抗ENA抗體（抗體： Sm、NrNP、SSA/RO、SSB/La 抗非組蛋白抗體 rRNP、SCL-70、PCNA、RA33） 抗著絲點(diǎn)抗體（ACA） 抗核仁抗體(抗體：RNA-Polymerase-1, PM-SCL/PM-1.) 抗其他細(xì)胞成分抗體（高爾基體、中心體、紡錘體、線粒體、溶酶 體、肌動(dòng)蛋白、 Vimrntin、細(xì)胞角蛋白、Lamin）ANA抗核抗體(ANA)的檢測(cè) 在實(shí)際工作中，不管用何種方法來(lái)檢測(cè)ANA，實(shí)際上都是指總抗核抗體檢測(cè)。ANA陽(yáng)性的疾病很多，最常見(jiàn)

21、于彌漫性結(jié)締組織病，某些非結(jié)締組織病也可陽(yáng)性（如慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、慢性淋巴性甲狀腺炎等），正常老年人也可出現(xiàn)低滴度的ANA陽(yáng)性（見(jiàn)表）。ANA陽(yáng)性標(biāo)志了自身免疫性疾病的可能性，ANA檢測(cè)在臨床上是一個(gè)極重要的篩選試驗(yàn)?？购丝贵w(ANA)的陽(yáng)性率SLE 95%PSS 70-80%MCTD 95%SS 60-70%PM/DM 50-60%RA 20-30%自身免疫性肝炎 80-90%正常人 5-20%間接免疫熒光法（IIF）： ANA無(wú)器官特異性和種屬特異性，大部分屬I(mǎi)gG類，僅少數(shù)為IgM、IgA。目前常用間接免疫熒光法（IIF）作為總的ANA的篩選試驗(yàn)。IIF檢測(cè)ANA時(shí)，所用抗原底

22、物片的種類甚多（見(jiàn)表)，目前廣泛應(yīng)用的是核質(zhì)豐富的培養(yǎng)細(xì)胞片或動(dòng)物器官組織冰凍切片。ANA檢測(cè)常用底物細(xì)胞片 培養(yǎng)細(xì)胞片人喉Ca上皮細(xì)胞 人喉Ca上皮細(xì)胞人子宮頸Ca細(xì)胞埃利鍥（Ehrlich）細(xì)胞小鼠腹水Ca細(xì)胞 動(dòng)物器官組織冰凍切片 鼠肝、 鼠腎 猴肝、 猴腎 兔肝、 兔腎 對(duì)底物片的要求 ： 對(duì)底物片的選擇要便于ANA檢測(cè)結(jié)果觀察（免疫染色模型）， 底物片所含抗原應(yīng)種類豐富、特異性強(qiáng)、含量高，否則就失去了ANA篩選檢測(cè)作用。兩種不同底物檢測(cè)ANA的陽(yáng)性率比較疾病 Hep-2細(xì)胞 冰凍切片SLE 99% 96%SS 85% 72%PSS 88% 40%RA 55% 24%JRA 40% 2

23、2% 由于不同底物因其含抗原的不完全相同，所以可能出現(xiàn)同一份標(biāo)本在不同的底物片上測(cè)定ANA時(shí)產(chǎn)生不同的結(jié)果，如鼠肝上SSA的含量只有Hep-2細(xì)胞的1/10，造成含SSA抗體陽(yáng)性血清在 鼠肝底物上呈陰性反應(yīng)，而于Hep-2細(xì)胞為底物則呈陽(yáng)性； 抗著絲點(diǎn)抗體（ACA）、抗PCNA抗體只與細(xì)胞活躍增殖的細(xì)胞核抗原反應(yīng)，用Hep-2等組織培養(yǎng)細(xì)胞可以檢出，而 鼠肝細(xì)胞增殖分裂不活躍，則不能檢出。這就說(shuō)明檢測(cè)ANA其底選擇尤為重要?，F(xiàn)已證明人細(xì)胞培養(yǎng)底物檢測(cè)ANA敏感性優(yōu)于動(dòng)物組織底物片。目前國(guó)際、國(guó)內(nèi)都通常采用Hep-2細(xì)胞作為ANA檢測(cè)底物。 文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用Hep-2細(xì)胞來(lái)檢測(cè)ANA較鼠肝（腎）冰

24、凍切片檢測(cè)ANA，陽(yáng)性率可提高10-20%左右。 ANA檢測(cè)IIF法 90%以上實(shí)驗(yàn)室使用Hep-2細(xì)胞為底物; 為人來(lái)源培養(yǎng)細(xì)胞（人喉癌細(xì)胞），據(jù)有核大、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰特點(diǎn)； 便于結(jié)構(gòu)觀察及熒光染色核型分析； 核抗原豐富、特異性強(qiáng)、有完整的ANAs；抗原譜(細(xì)胞核、漿、骨架、周期）； 可預(yù)測(cè)分析ANA靶抗原范圍； 經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。IIF法檢測(cè)ANA陽(yáng)性常見(jiàn)熒光染色模型細(xì)胞核 細(xì)胞漿 細(xì)胞骨架 細(xì)胞周期均質(zhì)型 核糖體型 肌動(dòng)蛋白型 中心體型核膜型 線粒體型 波形蛋白型 紡錘體型斑點(diǎn)型 高爾基體 中間體型核仁型 溶酶體型著絲點(diǎn) 顆粒型（粗、細(xì)）PCNA型核（多、少）點(diǎn)型IIF法檢測(cè)ANA陽(yáng)性常見(jiàn)熒光染色

25、模型 周邊型或核膜型（M）：熒光染色在核膜周?chē)?，此型與抗ds-DNA抗體有關(guān)。 均質(zhì)型（H）：核質(zhì)染色均勻一致，此型與抗組蛋白抗體，抗DNA抗體有關(guān)。 斑點(diǎn)型（S）：核質(zhì)染色呈斑點(diǎn)狀，抗可溶性核抗原（ENA）抗體常呈此種染色模型。 核仁型（N）：核仁著染熒光，此型針對(duì)核糖體、U3-RNP、RNA聚合酶等抗體多為此型。 著絲點(diǎn)型（ACA）：此型核內(nèi)均勻散布大小一致的著染熒光斑點(diǎn)，相關(guān)抗體為抗著絲點(diǎn)抗體，在鼠肝冰凍片為底物時(shí)不易檢出，須以培養(yǎng)細(xì)胞為底物方可檢出。 PCNA型：在與Hep-2細(xì)胞為底物時(shí)，熒光染色只在生活周期的幼稚細(xì)胞核呈顯著的斑紋染色而鄰近細(xì)胞核為陰性反應(yīng)。此型由抗增殖期細(xì)胞抗體引

26、起。關(guān)于IIF法檢測(cè)ANA熒光染色模型應(yīng)注意 1、 一種抗體可出現(xiàn)不同的染色圖型，不同的抗體亦可出現(xiàn)同樣的染色圖型。 2、有些染色圖型對(duì)ANA的判斷有特異性，如：ACA、PCNA、抗高爾基體等。 3、有些染色圖型有一定的提示作用，但僅根據(jù)染色圖型特點(diǎn)來(lái)推斷抗體的特異性是危險(xiǎn)的。 4、有時(shí)一份血清內(nèi)因含有多種抗體可出現(xiàn)不同的染色圖型，用不同稀釋度的血清檢測(cè)，可分清各種熒光染色圖型。ELISA法檢測(cè)ANA原理：利用ELISA法，搜集細(xì)胞核和細(xì)胞漿抗原，如ds-DNA、Histones、Sm、RNP、SSA、SSB、Scl-70、centromere、Jo-1等混合液包被微孔板，檢測(cè)抗核抗體。方法學(xué)

27、評(píng)價(jià) 自1957年Friou等首先用IIF法檢測(cè)抗核抗體以來(lái)，許多研究者對(duì)ANA檢測(cè)進(jìn)行了大量研究，但事實(shí)證明，只是在IIF法改良上有些進(jìn)展，如底物選擇及其制備方法改良等。 ELISA法與IIF法比較，有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀，無(wú)需熒光顯微鏡等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在一些醫(yī)院用ELISA法來(lái)作檢測(cè)ANA的篩選方法。由于ELISA法檢測(cè)ANA時(shí)，要復(fù)制細(xì)胞抗原的全部成分，這些抗原在細(xì)胞內(nèi)存在時(shí)相互間的濃度及自然抗原決定簇的二級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)是極其困難的，所以從目前來(lái)看，應(yīng)用組織培養(yǎng)細(xì)胞底物的IIF法仍然是檢測(cè)抗細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”。紅斑狼瘡細(xì)胞（LE-cell）的檢查L(zhǎng)E細(xì)胞SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)驗(yàn)指

28、標(biāo)之一（ARA，1982）方法：3ml血液-放置30分鐘-用竹竿搗碎-置37度水浴箱1小時(shí)-離心-取WBC層涂片染色-鏡檢。原理 LE因子是DNA組蛋白抗體（抗DNP抗體），當(dāng)病人血清中的這種抗核抗體在補(bǔ)體輔助下，與輕微受損傷（血液用玻璃珠沖撞或凝血后被搗碎）的白細(xì)胞核內(nèi)的DNA組蛋白復(fù)合物（DNP）起作用時(shí)，而形成均質(zhì)體（LE小體），均質(zhì)體再被中性粒細(xì)胞所吞噬并將細(xì)胞核推向一邊，即形成典型的LE細(xì)胞。涂片中還可見(jiàn)到游離的LE小體或其周?chē)卸嗪肆＜?xì)胞現(xiàn)象。形成因素：（1）、ANA（LE因子），（2）、損傷的白細(xì)胞，（3）、補(bǔ)體，（4）、有活躍吞噬功能的多形核細(xì)胞。LE因子： DNA組蛋白抗體（

29、抗DNP抗體）LE細(xì)胞檢查：操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，特異性、敏感性差，陽(yáng)性率低。1994年美國(guó)臨床病理家協(xié)會(huì)（ASCP）LE細(xì)胞檢查：過(guò)時(shí)、廢棄的實(shí)驗(yàn)。替代試驗(yàn)：抗DNP抗體 抗核小體抗體 ANA 抗dsDNA抗體 抗sm抗體?？笵NP抗體的檢測(cè)-乳膠凝聚法原理 從小牛胸腺中提取脫氧核糖核蛋白（DNP）抗原，致敏聚苯乙烯乳膠，制成抗DNP抗體乳膠凝聚試劑，當(dāng)血清中存在抗DNP抗體時(shí)，便與乳膠顆粒上的DNP抗原結(jié)合，使乳膠顆粒相互凝聚出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝聚顆粒。根據(jù)凝聚反應(yīng)強(qiáng)弱判斷陽(yáng)性強(qiáng)度。臨床意義 正常人無(wú)此抗體，陽(yáng)性時(shí)主要見(jiàn)于SLE，SLE活動(dòng)期陽(yáng)性可達(dá)80-90%，非活動(dòng)期陽(yáng)性率為20%左右。其它

30、結(jié)締組織病等陽(yáng)性率低，且部分病人合并SLE癥狀，某些非結(jié)締組織?。ㄈ绺窝椎龋┡家?jiàn)陽(yáng)性?？笵NP抗體乳膠凝聚試驗(yàn)為SLE的十分重要的過(guò)篩試驗(yàn)。陽(yáng)性，特別是（+）以上時(shí)要高度考慮為SLE診斷，陰性結(jié)果時(shí)，SLE的診斷要慎重。方法學(xué)評(píng)價(jià) 抗DNP抗體乳膠凝聚試驗(yàn)又稱LE因子試驗(yàn)，該試驗(yàn)敏感性、特異性均高于傳統(tǒng)的LE細(xì)胞檢查方法，且操作簡(jiǎn)單、快速，可作為L(zhǎng)E細(xì)胞檢查替代試驗(yàn)，是SLE診斷及病情觀察的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)。抗DNA抗體的檢測(cè)抗DNA抗體的分類及臨床意義抗DNA抗體分為：（1）、抗單鏈DNA抗體（抗ss-DNA），（2）、抗雙鏈DNA抗體（抗ds-DNA），（3）、抗z-DNA抗體。（1）、抗

31、ss-DNA抗體：對(duì)疾病診斷缺乏特異性，雖然SLE病人中其陽(yáng)性率為70%，但也可以在多種風(fēng)濕性疾病或非風(fēng)濕性疾病中出現(xiàn)，正常老年人也有抗ss-DNA抗體，故臨床上無(wú)實(shí)用價(jià)值。（2）、抗ds-DNA抗體：主要見(jiàn)于SLE，陽(yáng)性率在50%左右，其中陽(yáng)性者90%以上為活動(dòng)期患者，而在非SLE患者和正常人則多為陰性。有時(shí)其它結(jié)締組織病患者抗ds-DNA抗體也可陽(yáng)性，如SS、DLE、MCTD等，但陽(yáng)性率低，一般95%。出現(xiàn)高效價(jià)的抗RNP抗體且無(wú)其他特異性的抗核抗體，是診斷MCTD的重要血清學(xué)依據(jù)。但此抗體可在多種風(fēng)濕病中出現(xiàn)，并不具有診斷特異性。 Sm和RNP是同一分子復(fù)合物（RNA-蛋白質(zhì)顆粒）中的兩

32、個(gè)位點(diǎn)，兩種抗原具有相關(guān)性，分離提純十分困難。臨床上Sm抗體陽(yáng)性者常同時(shí)伴有RNP抗體陽(yáng)性，單一抗Sm抗體陽(yáng)性者很少見(jiàn)。（3）、抗SSA和抗SSB抗體 在SLE患者中，抗SSA和抗SSB抗體陽(yáng)性率分別為35%和15%：在SS患者中抗SSA和抗SSB抗體陽(yáng)性率分別為60%和40%?？梢钥闯觯筍SA抗體和抗SSB抗體與口眼干燥癥有關(guān)，且抗SSA抗體敏感性高于抗SSB抗體，但抗SSB特異性則優(yōu)于抗SSA抗體?？筍SA和抗SSB抗體的測(cè)定提高了SS的診斷率。（4）、抗Scl-70（DNA拓樸異構(gòu)酶-1抗體） Scl-70抗原是DNA拓樸異構(gòu)酶-1（天然分子量為100KD）的降解產(chǎn)物，分子量70KD的

33、抗原片段。因該抗體僅出現(xiàn)在進(jìn)行性系統(tǒng)性硬皮?。≒rogressive Systemic Sclerosis，PSS）患者，其分子量為70KD而得名。一般未經(jīng)選擇的PSS患者，其陽(yáng)性率為25%，而重癥彌漫型硬皮病患者，其陽(yáng)性率為75%。抗Scl-70抗體，在其它結(jié)締組織病和非結(jié)締組織病極少陽(yáng)性，正常人均陰性。通常將抗Scl-70稱為PSS的標(biāo)記抗體。(5)、抗Jo-1抗體 一般在多發(fā)性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）中檢測(cè)到，因此該抗體陽(yáng)性是PM/DM的血清標(biāo)記抗體。由于該抗體陽(yáng)性的患者臨床上常有關(guān)節(jié)炎，皮肌炎及肺部間質(zhì)性病變的表現(xiàn)，因此該部分患者常因關(guān)節(jié)炎癥狀或肺部癥狀，被誤診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或肺

34、部感染。 抗心磷脂抗體（ACL） 抗心磷脂抗體（Anti-Cardiolipin Antibodies ACL）是抗磷脂抗體中的一個(gè)重要組成部分，可在多種結(jié)締組織病中出現(xiàn)，抗心磷脂抗體可分為IgA、IgM、IgG。研究表明ACL在SLE中陽(yáng)性率為30%，其次在RA中陽(yáng)性率為23%，都以IgG型為主。在SLE病人當(dāng)中ACL陽(yáng)性者狼瘡腦病的發(fā)病率明顯高于ACL陰性患者，另外，血小板減少，血管栓塞和習(xí)慣性流產(chǎn)也與ACL抗體密切相關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷 類風(fēng)濕因子（Rheumatoid Factor RF）是IgGFc端的自身抗體，因?yàn)樗强贵w（即IgG）的對(duì)應(yīng)抗體，故也稱為抗抗體。RF

35、可以是IgG、IgA、IgM型，現(xiàn)在一般說(shuō)的RF是指IgM類風(fēng)濕因子。 RF出現(xiàn)于的RA病人血清中，約30%的SLE、約50%的SS，部分MCTD和少數(shù)PSS病人也可呈陽(yáng)性，在某些病毒、原蟲(chóng)、細(xì)菌感染和腫瘤等非自身免疫病患者也可以出現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外常規(guī)測(cè)定的為IgM-RF，測(cè)定的方法是人IgG包被乳膠凝聚試驗(yàn)。其原理為IgM有5個(gè)單體，每個(gè)單體都可以和乳佼包被的IgGFC端結(jié)合而產(chǎn)生明顯的凝聚現(xiàn)象，IgG類風(fēng)濕因子是單體，與乳膠凝聚不明顯，故需用更敏感的放射免疫法或酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。 RA是一種最常見(jiàn)的自身免疫性疾病，在全世界大約有1%的人患有此病。是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥的慢性自身免疫性疾病，其預(yù)后變異大，輕者發(fā)生輕度關(guān)節(jié)畸形，重者則發(fā)生嚴(yán)重致死性病變。RA診斷和治療晚，則療效不滿意。早期診斷和治療，炎癥有可能發(fā)生可逆性改變，這就顯得RA的早期診斷極為重要。RA的早期診斷指標(biāo)有類風(fēng)濕因子（RF）： 陽(yáng)性率為79%，特異性為63%?？购酥?/p>