感染性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷

1、感染性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊 青不適當(dāng)初始抗菌治療將導(dǎo)致病死率顯著提高不充分初始治療充分初始治療A post-antibiotic era is instead a very real possibility for the 21st century-WHO提高抗感染水平的關(guān)鍵-正確的診斷感染的診斷 感染類型，感染部位病原體的診斷 獲得確切的病原體耐藥性的診斷 耐藥菌的種類 耐藥機(jī)制明確感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷血清學(xué)方法分子生物學(xué)方法培養(yǎng)直接鏡檢法 體外藥敏試驗(yàn)病例1患者男性，33歲，有18年乙肝病史6.27患者無明顯誘因地出現(xiàn)頭痛伴發(fā)熱，體溫最高達(dá)3

2、8.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃納差，惡心6.30在杭州某醫(yī)院就診，血常規(guī)：白細(xì)胞7.410E9/L，淋巴細(xì)胞3.610E9/L，超敏CRP10mg/l，擬診為“腦炎”，建議患者住院行腰穿，患者拒絕7.1來我院就診，頭顱CT未見異常血培養(yǎng)結(jié)果成為診斷的關(guān)鍵7.1血培養(yǎng)：馬耳他布魯菌采血指徵 發(fā)熱（38C）或低溫（36C）、寒戰(zhàn)、呼吸快 白細(xì)胞增多（計(jì)數(shù)大于10，000109/L，特別有“核左移” 未成熟的或桿狀核）、CRP升高 皮膚粘膜出血 血壓降低、昏迷、多器官衰竭 血液?。毫＜?xì)胞減少（成熟的多核白細(xì)胞105CFU/ml，陽性菌104CFU/ml1、有無癥狀2、是否使用抗菌藥物3、尿是否在

3、膀胱存留3h以上4、是否為清潔中段尿5、是否2h之內(nèi)送檢6、導(dǎo)尿袋膿液或創(chuàng)面分泌物標(biāo)本應(yīng)區(qū)分淺表、深部或手術(shù)切口皮膚消毒非常關(guān)鍵開放性損傷，無菌生理鹽水擦洗病灶表面未潰破的膿腫宜用碘酒、酒精消毒皮膚取材部位最好為損傷基底部或病變有進(jìn)展的邊緣，不可僅為膿液涂片評價(jià)標(biāo)本的質(zhì)量，快速報(bào)告 清潔后金葡菌為主清潔前取樣數(shù)種凝固酶陰性葡萄球菌病例3患者女，55歲，因“腎移植術(shù)后半年，反復(fù)發(fā)熱一月余，加劇伴關(guān)節(jié)痛6天”入院。 2月余前，患者因扭傷右腳踝關(guān)節(jié)，并出現(xiàn)發(fā)熱，來我院住院治療，體溫基本正常后出院。1月余再次出現(xiàn)發(fā)熱，入院后予泰能0.5克BID抗感染治療5天，體溫正常出院。患者1月前再次出現(xiàn)發(fā)熱，體溫

4、最高達(dá)40度，再次住院治療，予以可樂必妥500mg靜滴抗感染治療，好轉(zhuǎn)出院。6天前，患者無明顯誘因下，右側(cè)踝關(guān)節(jié)疼痛再發(fā)，伴有高熱，體溫最高達(dá)39，偶有胸悶，3.26再次于本院就診入院革蘭染色：可見有折光性菌體抗酸染色（4+）血清學(xué)診斷方法優(yōu)點(diǎn)快速報(bào)告結(jié)果敏感性提高取材簡便多以真菌在致病狀態(tài)產(chǎn)生的物質(zhì)為檢測標(biāo) 志物，結(jié)果陽性提示有致病性定量檢測可判斷感染嚴(yán)重程度及療效評估乳膠凝集試驗(yàn)：以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。即吸附新型隱球菌莢膜多糖抗原于其表面，特異性抗體與之結(jié)合后，產(chǎn)生凝集反應(yīng)膠體金法：新型隱球菌莢膜多糖抗原檢測陰性陽性隱球菌腦膜炎中的應(yīng)用李娟等報(bào)道墨汁染色涂片診斷隱球菌腦膜炎

5、靈敏度61.1（11/18),腦脊液真菌培養(yǎng)靈敏度38.9(7/18),隱球菌抗原檢測靈敏度100(18/18)，特異度99.4%(149/150)劉正印等報(bào)道墨汁涂片染色陽性23例(23/26,88%)，乳膠凝集試驗(yàn)抗原陽性20例(20/20，100%)，培養(yǎng)陽性8例(8/13,62%)大多數(shù)研究報(bào)道靈敏度93100%，特異性 9398%李娟,呂曉菊,等.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2010, 41(6): 1074-1075, 1079劉正印,王愛霞,等. 中華內(nèi)科雜志, 2002, 41(8): 541-543肺部隱球菌病中 的應(yīng)用GM試驗(yàn) 檢測底物：曲霉細(xì)胞壁成分半乳甘露聚糖(菌絲在組織

6、生長過程中釋放) 標(biāo)本：血清、肺泡灌洗液方法：ELISA雙抗體夾心法 cut-off值：ODI 0.5 兩次ODI 0.5或一次ODI 0.7提高陽性預(yù)測值GM試驗(yàn)的臨床價(jià)值血清GM推薦用于惡性血液腫瘤患者和造血干細(xì)胞移植患者（未進(jìn)行抗真菌治療）早期診斷非粒缺、實(shí)體器官移植（SOT）、ICU患者、已開始抗真菌治療，建議同時(shí)測定BALF GM半乳甘露聚糖水平的動態(tài)變化反應(yīng)抗真菌藥物療效，指導(dǎo)抗真菌藥物使用47假陽性哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸與真菌成分有交叉反應(yīng) （組織胞漿菌、皮炎芽生菌、青霉、鐮刀霉、頭狀地霉等）谷類食物中的GM抗原經(jīng)腸道入血，化療并且出現(xiàn)嚴(yán)重黏膜炎的患者更

7、容易發(fā)生這種吸收 G試驗(yàn) 檢測底物： (1-3)-D-葡聚糖(真菌細(xì)胞壁成分50%) 標(biāo)本：血清（無熱源采血管），3h內(nèi)送檢方法：比濁法或比色法 cut-off值：不同試劑盒不同G試驗(yàn)可檢測念珠菌、毛孢子菌、曲霉、鐮刀霉、支頂孢霉、卡氏肺孢子菌，不能檢測隱球菌、接合菌 G試驗(yàn)的臨床價(jià)值目前主要用于侵襲性念珠菌和曲霉感染的診斷、高危人群的監(jiān)測以及對療效、預(yù)后的評價(jià)對于區(qū)分確診或擬診侵襲性真菌感染與非侵襲性真菌感染患者，有良好的準(zhǔn)確性連續(xù)檢測可動態(tài)反應(yīng)真菌感染程度和抗真菌治療療效50假陽性污染（試管、槍頭、蒸餾水）血液透析、腹膜透析（纖維素膜透析）外科手術(shù)使用紗布抗腫瘤多糖靜脈制劑（白蛋白、免疫球

8、蛋白、凝血因子）51動態(tài)監(jiān)測臨床應(yīng)用WBC 白細(xì)胞計(jì)數(shù)Endotoxin 內(nèi)毒素IL-6 白介素-6IL-10 白介素-10TNF 腫瘤壞死因子Procalcitonin 降鈣素原CRP C反應(yīng)蛋白Protein CHMG-1sTREM-1.選擇合適血清學(xué)指標(biāo)，幫助臨床判斷感染的類型、嚴(yán)重程度及療效依據(jù)生理生化特征進(jìn)行鑒定的傳統(tǒng)方法面臨很多的困難費(fèi)時(shí)，對于分枝桿菌、厭氧菌等需要更長時(shí)間廣譜抗菌藥物的使用極大降低了培養(yǎng)的陽性率苛養(yǎng)和少見細(xì)菌感染增加常規(guī)的自動化鑒定儀鑒定菌種范圍有限，有時(shí)無法準(zhǔn)確鑒定到種分子生物學(xué)技術(shù)在臨床的應(yīng)用基于基因擴(kuò)增及測序技術(shù)的快速鑒定蛋白質(zhì)譜對可培養(yǎng)病原菌的快速鑒定16

9、S rRNA序列測定已成為疑難病原菌檢測和鑒定的常用方法Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF核酸檢測采用Cepheid公司GeneXpert檢測系統(tǒng)，是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變，進(jìn)而用于診斷患者是否結(jié)核以及是否對利福平耐藥（rpoB序列存在突變）?？赏瑫r(shí)檢測患者是否結(jié)核以及是否對利福平耐藥對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性兩小時(shí)內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，所用儀器設(shè)備簡單HIV患者Tspot 結(jié)果陰性GeneXpert檢測系統(tǒng)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥性檢測（芯片法）病例4患者

10、男性，72歲，3月前無明顯誘因出現(xiàn)咳嗽咳痰，檢查“痰找抗酸桿菌+”，“ CT兩中肺結(jié)核右下肺、左下肺炎”，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷“肺結(jié)核”，給予“異煙肼乙胺丁醇利福平”抗結(jié)核治療20天后，出現(xiàn)藥物性肝損，護(hù)肝降酶治療效果不佳，TBIL進(jìn)行性升高，2011.4.14 “TBIL275.4umol/l”5.16痰找抗酸桿菌抗酸桿菌？結(jié)核桿菌？非結(jié)核分支桿菌？奴卡菌？痰培養(yǎng)：16sRNA PCR 證實(shí) 為鼻疽奴卡菌痰結(jié)核菌培養(yǎng)基因芯片雜交 結(jié)核分支桿菌陰性 鳥分支桿菌陽性鳥分支桿菌的治療對異煙肼（INH）及吡嗪酰胺（PZA）耐藥每周三次給藥：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、 乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，治療6個月

11、Agns Ferroni et al, JCM, 2010A. Bizzini et al, JCM, 2010基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法MALDI-TOF MS原理：用特異性的多肽、蛋白質(zhì)譜進(jìn)行菌種鑒定優(yōu)勢：快速：20min之內(nèi)即可得到結(jié)果，是現(xiàn)有方法中最快的陽性血培養(yǎng)鑒定法、純菌株大約10分鐘高特異性和敏感性：接近100%對部分混合感染樣本的準(zhǔn)確鑒定不足：多報(bào)道用于鑒定細(xì)菌，酵母菌及分枝桿菌需要建立嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫體系進(jìn)行比對分析應(yīng)用范圍：純培養(yǎng)菌株、或報(bào)警陽性的血培養(yǎng)瓶檢測病例5男性，50歲，因“咳嗽咳痰伴左頰部潰瘍3月”入院病例特點(diǎn)：3月前患者無明顯誘因下出現(xiàn)陣發(fā)性咳嗽咳痰，繼而出現(xiàn)惡心嘔吐，伴有乏力當(dāng)?shù)谻T：兩肺多發(fā)感染，兩肺多發(fā)