反硝化細(xì)菌項目說明書

1、一直位居世界第一。據(jù)統(tǒng)計，2004年我國水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到3209萬噸，占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的三分之二以上。但目前主要采用的集約化高密度養(yǎng)殖，如施肥給餌和密集輪養(yǎng)等養(yǎng)殖方式，會在養(yǎng)殖水體中積累大量的魚類糞便、食物殘渣和死亡的動植物尸體，導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo)，富營養(yǎng)化情況嚴(yán)重，魚蝦病害頻頻發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤其是高檔精養(yǎng)池塘造成巨大損失。作為水體氮素存在形式之一的亞硝酸鹽的控制一直是水產(chǎn)科學(xué)工作者研究的熱點。這是因為它是水產(chǎn)動物致病的根源之一，其危害主要表現(xiàn)在它可以將魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使其喪失運(yùn)輸氧的能力，從而造成魚蝦的窒息死亡。我國淡水漁業(yè)用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,養(yǎng)殖水質(zhì)中的亞

2、硝酸鹽氮應(yīng)控制在0.2ppm以下，河蟹、對蝦育苗水質(zhì)的亞硝酸鹽氮應(yīng)控制在0.1ppm以下。本項目研究的生物修復(fù)技術(shù)是一種治污新模式，通過定向富集，從污水處理池活性污泥中篩選出TIN去除率較高的好氧反硝化細(xì)菌，并在實驗室條件下，對該菌株在天然水體中的反硝化活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，制作出可用于生物脫氮的微生態(tài)菌劑在廢水處理方面,同步硝化反硝化相對于傳統(tǒng)的生物脫氮工藝具有明顯的優(yōu)勢。通過微生態(tài)制劑的直接投放，以及魚類和水生植物的協(xié)同作用達(dá)到凈水的目的。它具有高效、無二次污染，成本低、投資省，使用簡單易操作等特點。本著消除污染，篩選高效去除水體富營養(yǎng)化的微生物菌劑，進(jìn)而促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。利用活性污泥篩

3、選出TIN去除率較高的好氧反硝化細(xì)菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。作品研究內(nèi)容2.1研制目的本著充分利用資源、消除污染，制取可高效去除水體富營養(yǎng)化的微生物制劑，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展為目的。而從活性污泥中篩選好氧反硝化細(xì)菌。2.2實驗材料和方法2.2.1實驗主要儀器、料及試劑主要儀器:超凈工作臺（SWCJ-A），高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱（SPX-160型），搖床（HNY-200D），電子天平等。主要原料及試劑:BTB培養(yǎng)基（瓊脂20g、KN031g、KH2PO41g、FeCI26H2O0.5g、CaCI27H2O0.2g、MgSO47H2O

4、1g、琥珀酸鈉8.5g、溴百里酚藍(lán)（BTB）（1%乙醇溶液）1mL,用1moI/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.07.3,121C滅菌20min）,LB培養(yǎng)基（KNO31g、KH2PO41g、FeCI26H2OO.O5g、CaCI27H2OO.O2g、MgSO47H2O1g、琥珀酸鈉8.5g,121C滅菌20min）。格里斯試劑A、B液，二苯胺試劑，其他試劑均分析純。1.2.2取樣南陽市污水處理廠曝氣池中活性污泥；南陽師院十二里河污泥；南陽師院陽子湖湖水；南陽師院周圍麥田土樣2.2.3實驗方法2.2.3.1.好氧反硝化細(xì)菌的初篩采用梯度稀釋法將污泥樣品稀釋至適當(dāng)濃度，取O.ImL均勻涂布于BTB培養(yǎng)

5、基表面，置入恒溫培養(yǎng)箱，30工下培養(yǎng)23d后，用接種環(huán)挑取使周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的單菌落，進(jìn)行分離純化即為初篩菌株。2.2.3.2.好氧反硝化細(xì)菌的復(fù)篩將初篩篩選出的好氧菌株接種到LB液體培養(yǎng)基的試管中，每支試管分裝培養(yǎng)基的高度約為45cm,每株重復(fù)3管，在30C恒溫下培養(yǎng)7d以上，每天觀察其生長情況，檢查試管是否混濁。并用格里斯(Griess)試劑檢查培養(yǎng)液中是否已出現(xiàn)亞硝酸根。如果呈桃紅或紅色反應(yīng)，說明硝酸鹽已經(jīng)在反硝化菌作用下生成亞硝酸鹽，即為正反應(yīng)。如為負(fù)反應(yīng)，則就要檢查培養(yǎng)液中是否還有硝酸根，即置白瓷板凹窩中加濃硫酸和二苯胺試液各2滴，然后滴入待測液12滴，如果有藍(lán)色出現(xiàn)，說明有硝

6、酸根存在，即未進(jìn)行反硝化作用，受檢查管無反硝化細(xì)菌存在，如不出現(xiàn)藍(lán)色，則說明硝酸根已完全消失，且作為硝化作用中間產(chǎn)物的亞硝酸根也完全消失，這證明受檢查管的反硝化作用很強(qiáng)烈，有反硝化細(xì)菌存在，檢查時應(yīng)與空白對照，將檢出具有反硝化作用的好氧菌作為復(fù)篩菌91，并將其接種于3號培養(yǎng)基的試管斜面，作為備用菌。2.3分析方法該方法是利用在培養(yǎng)液中滴加格里斯試劑、二苯胺試劑和奈氏試劑,通過顯色反應(yīng)指示亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的變化31,從而篩選出對硝態(tài)氮有較強(qiáng)利用效果的菌株。在培養(yǎng)液中加入12滴格里斯試劑，以檢測是否有亞硝酸鹽的存在，如溶液立即呈粉紅色或棕色等,則硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽,說明該溶液中具有好氧

7、反硝化作用的細(xì)菌。如無紅色出現(xiàn),再加入二苯胺試劑,若培養(yǎng)液呈藍(lán)色,則表示該培養(yǎng)液中硝酸鹽未被轉(zhuǎn)化,溶液中無反硝化細(xì)菌;若無色,則表示硝酸鹽和剛生成的亞硝酸鹽都已原成氮氧化物,說明該溶液中具有較強(qiáng)好氧反硝化功能的細(xì)菌。2.3菌株的分離與鑒定從十二里河的污泥中篩選到20株生長比較旺盛，反硝化能力較強(qiáng)的好氧反硝化細(xì)菌，分別接入含有硝酸鉀的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3d通過格里斯試劑檢測菌株的反硝化速度，先有無色粉紅色玫瑰紅色棕色無色(滴入二苯胺仍為無色)先完成這個過程的細(xì)菌反消化能力較強(qiáng)，每隔12個小時檢測一次，從中篩選8株菌做鑒定。菌株編號格里斯試劑檢測結(jié)果12h后24h后36h后48h后1粉紅色玫瑰紅

8、色棕色無色2無色粉紅色玫瑰紅色棕色3粉紅色玫瑰紅色棕色無色4無色無色粉紅色玫瑰紅色5無色無色粉紅色玫瑰紅色6粉紅色玫瑰紅色棕色無色7無色粉紅色玫瑰紅色棕色8無色粉紅色玫瑰紅色棕色9粉紅色玫瑰紅色棕色無色10無色粉紅色玫瑰紅色棕色11粉紅色玫瑰紅色棕色無色12無色無色粉紅色玫瑰紅色13粉紅色玫瑰紅色棕色無色14無色粉紅色玫瑰紅色棕色15粉紅色玫瑰紅色棕色無色16無色粉紅色玫瑰紅色棕色17粉紅色玫瑰紅色棕色無色18無色粉紅色玫瑰紅色棕色19無色無色粉紅色玫瑰紅色20無色無色無色粉紅色通過上表分析得1、3、6、9、11、13、15、17號菌株為反硝化能力強(qiáng)的優(yōu)勢菌株。將8株菌接種后第2天即產(chǎn)生大量氣

9、泡,迅速降解亞硝態(tài)氮和總氮的菌株。6號菌株通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察鑒定該菌株為革蘭式陽性菌株，同時進(jìn)行顯微拍照觀察該菌的外形為球形。2.4菌株反硝化特性靜置培養(yǎng)條件下，菌株在接種后的3h進(jìn)入了對數(shù)生長期，在10h菌體濃度達(dá)到最高，隨后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，在23h左右進(jìn)入衰亡期。在對數(shù)生長期，由于培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，此時用于菌體增殖的氮源主要是培養(yǎng)基中的有機(jī)氮，而在生長穩(wěn)定末期及衰亡期，菌體基本不再增殖，此時培養(yǎng)基中的亞硝態(tài)氮濃度的變化應(yīng)該是由于反硝化作用引起的。反硝化碳源通常分為三種類型:第一類是易于生物降解的有機(jī)物,如實驗中采用的甲醇、乙醇、蔗糖、葡萄糖等;第二類為可慢速生物降解的

10、有機(jī)物,如實驗中的可溶性淀粉等;第三類為細(xì)胞物質(zhì),細(xì)菌會利用細(xì)胞成分進(jìn)行內(nèi)源反硝化。碳源的種類對菌株的反硝化活性有很大影響。一般來說，在反硝化過程中，易于生物降解的有機(jī)物是最好的電子供體，不僅反硝化速率快，還能夠提高生物處理裝置的能力和效率，使反硝化過程穩(wěn)定可靠102.5反硝化碳源試驗以LB培養(yǎng)基（KN031g、KH2PO41g、FeCI26H200.05g、CaCI27H200.02g、MgSO47H2O1g、蒸餾水1000ml、PH7.07.3為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入不同碳源檸檬酸鈉10g、乙醇10g、醋酸鈉10g、葡萄糖10g、可溶性淀粉10g、甲醇10g作為唯一碳源配制培養(yǎng)基。按1%接種

11、量接入活化并用無菌水洗滌干凈的菌液，30弋靜置培養(yǎng)60h后檢測培養(yǎng)基中亞硝態(tài)氮的降解率。2.5.1.BTB平板篩選法該方法適用于對培養(yǎng)條件有特殊營養(yǎng)要求的某種好氧反硝化菌的定向篩選。運(yùn)用此方法在好氧條件下，利用平板的抑菌圈大小，篩選到對不同碳源適應(yīng)能力不同的20株好氧反硝化細(xì)菌菌株。2.6菌株在天然養(yǎng)殖水體中的反硝化特性取回的陽子湖水樣經(jīng)處理后,分為兩部分，一份加入硝酸鉀（氮源）和葡萄糖（碳源），分別取50ml分裝于四個錐形瓶中，一組只加入硝酸鉀，取50ml裝入一個錐形瓶中，121弋,30口滅菌處理后，將不同濃度的菌種（1ml）接入錐形瓶中，28弋恒溫培養(yǎng)。用格里斯試劑定時檢測顏色變化。加N、

12、C只加N無C加N、C加N、C加N、C投菌濃度（個/L）檢測時間（h）不投菌3x1073x1073x1083x10912h無色無色無色粉紅色玫瑰紅色16h無色無色無色玫瑰紅色棕色20h24h30h36h2.7投菌濃度試驗將不同濃度的菌種投入陽子湖水中，用格里斯試劑定時檢測降解天然水中氮的速度?；饔?有必要從實際應(yīng)用的可操作性出發(fā),確定合適的投菌量。隨著投菌量的增加，亞硝態(tài)氮的降解率逐漸升高；當(dāng)投菌濃度達(dá)到108個/L時，菌株即可在水體中發(fā)揮高效的反硝化作用。說明該菌株具有較強(qiáng)的生存能力和環(huán)境適應(yīng)能力，在天然水體中具有較強(qiáng)的競爭力。2產(chǎn)品性能分析生物脫氮以其無污染、脫氮徹底等優(yōu)點被認(rèn)為是目前最經(jīng)

13、濟(jì)、有效、可行性高的水體除氮方法。但由于種種原因,目前國內(nèi)外市場尚無可有效治理水體亞硝態(tài)氮污染的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。分離得到的微生物菌劑已在國內(nèi)多個水塘進(jìn)行了中試試驗,均取得了良好的脫氮效果。加之芽孢桿菌具有很強(qiáng)的生命力和旺盛的繁殖能力，能適應(yīng)各種不良的環(huán)境條件，受水體酸堿度、鹽度等影響較小，因此該菌株具有開發(fā)成微生態(tài)制劑應(yīng)用于受污染水體脫氮的巨大潛力。研制結(jié)論及應(yīng)用本研究采用定向富集（反復(fù)篩選）的方法，從污水處理池活性污泥中篩選出IN去除率較高的好氧反硝化細(xì)菌。該方法操作簡便、可行，反復(fù)篩選具有成本低、易操作、達(dá)標(biāo)排放可靠性強(qiáng)且無二次污染等優(yōu)點。具有較好的科學(xué)性和先進(jìn)行。不僅降低了工業(yè)廢水對水體

14、環(huán)境的危害，還可制得環(huán)保、高效去除水體富營養(yǎng)化的微生物菌劑，由此帶來的環(huán)境效益和社會經(jīng)濟(jì)效益是非常顯著的。該制備技術(shù)具有如下特：1方法操作簡便、可行，反復(fù)篩選具有成本低、易操作、達(dá)標(biāo)排放可靠性強(qiáng)且無二次污染等優(yōu)點。2使硝化/反硝化反應(yīng)在同一個反應(yīng)器中進(jìn)行，可以大大減少占地面積和建設(shè)資金3可以減少處理過程中加入調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH值的化學(xué)物質(zhì)，降低成本;好氧反硝化細(xì)菌在處理過程中更容易控制。42它的發(fā)現(xiàn)打破了反硝化只能在缺氧或厭氧條件下進(jìn)行的傳統(tǒng)觀點,為新型生物脫氮提供了新思路.應(yīng)用按本方法篩選到的好氧反硝化細(xì)菌市場潛力大，推廣應(yīng)用前景廣闊，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益我國每年用于環(huán)境污染投資約為830億元，約占

15、當(dāng)年GDP的1%。盡管如此，水環(huán)境污染趨勢仍然沒有得到有效控制，每年由于水質(zhì)污染引起的損失共約為500億元。同時，項目實施后可安排社會閑散人員就業(yè)，減輕就業(yè)壓力，產(chǎn)生較好的社會效益。利用活性污泥篩選出TIN去除率較高的好氧反硝化細(xì)菌，不僅能減少工業(yè)廢水對環(huán)境的污染，而且能充分利用資源，變廢為寶，具有顯著的環(huán)境效益。附錄：BTB培養(yǎng)基平板初篩復(fù)篩過程中抑菌圈篩選的好氧反硝化菌斜面保存的形態(tài)特征圖格里斯試劑染色后六號好氧反硝化菌株油鏡下顯微觀察照片(10 x100)格里斯試劑的顯色反應(yīng)圖示參考文獻(xiàn)沈萍微生物學(xué).MJJ匕京:高等教育出版社，2000,154翟茜,汪蘋,李秀婷，等活性污泥中好氧反硝化菌的富集篩選及鑒別J環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2007,30(1):11-14國家環(huán)保局編委會水和廢水監(jiān)測分析方法(第3版)M.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,1989黃運(yùn)紅，馮香玲,龍中兒，等好氧反硝化有效微生物群的篩選及特性研究J安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(36):11977-11979王弘宇，馬放，蘇俊峰，等不同碳源和碳氮比對一株好氧反硝化細(xì)菌脫氮性能的影響J.環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2007,27(6):968-972李平,張山,劉德立.細(xì)菌好氧反硝化研究進(jìn)展.微生物學(xué)雜志,2005,25(1):60-64.項慕飛,汪蘋,李秀婷,等.廢水脫氮系統(tǒng)中好氧反硝化菌的篩選與鑒定.食品科