瓊脂糖凝膠電泳示意圖

1、瓊脂糖凝膠電泳示意圖 血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。 雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白雞的紅細胞人的紅細胞(一)蛋白質分離和提取的原理一.基礎知識根據蛋白質各種特性的差異：分子的形狀、大小電荷性質和多少溶解度 吸附性質對其他分子親和力 （二）蛋白質提取和分離的方法凝膠色譜法：又稱分配色譜法電泳法1.凝膠色譜法2）材料：凝膠(分配色譜法)1）概念 根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法 凝膠是微小的多孔性球體，多糖類

2、化合物如葡聚糖或瓊脂糖。內部有許多貫穿的通道。 3）凝膠色譜法的原理分子篩效應 大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快； 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內部，路程長，流動慢。4）分離過程 混合物上 柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收 集大分子收 集小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。 2.電泳1)概念帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程瓊脂糖凝膠電泳示意圖2)原理 分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子大小，形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。3)類型:瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳4)實例：SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳用途: 測

3、定蛋白質的分子量 鑒定蛋白質的純度原理：SDS能與各種蛋白質形成蛋白質SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有電荷量。使電泳遷移率完全取決于分子的大小。討論：如何測定蛋白質的分子量？ 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質的分子量。 (三)緩沖溶液 抵制外界的酸或堿對溶液pH值的影響，維持pH基本不變1.作用如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4 說出人體血液中緩沖液?2.配制 通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制

4、得在不同PH范圍內使用的緩沖液。 3.提問：在本課題中使用的緩沖液是磷酸緩沖液二.實驗操作(1)紅細胞的洗滌(2)血紅蛋白的釋放(3)分離血紅蛋白溶液樣品處理粗分離純化純度鑒定透析除去分子較小的雜質通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度跳轉紅細胞1.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL低速離心2 min紅細胞血 漿5倍體積生理鹽水攪拌10min3g檸檬酸鈉吸出血漿重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入 了哪些物質？2.為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分攪拌的目的是_。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂3.分離血紅蛋白紅細胞破碎混合液高速離心10min （無色透明）（白色薄層固體）（紅色透明液體）（暗紅色）用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。粗分離透析除去樣品中分子量較小的雜質過程透析目的20mmol/L磷酸緩沖液1mL純化凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填3.樣品的加入和洗脫注意事項1. 紅細胞的洗滌： 洗滌次數不能過少；低速、短時離心。2. 凝膠的預處理： 沸水浴法時間短，