專題四核酸鑒定技術教學課件

1、核酸鑒定技術專題四第1頁，共75頁。鑒定的內容濃度和純度單一性構型目的分子序列第2頁，共75頁。主要內容核酸的物理化學性質核酸的大小核酸的構型常規(guī)核酸的電泳檢測技術核酸分子雜交鑒定技術經(jīng)典DNA序列分析技術第3頁，共75頁。核酸的物理化學性質紫外吸收：260nm大小：從幾個到1011nt構型：超螺旋，解旋序列：功能：第4頁，共75頁。核酸的紫外吸收嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一強烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。第5頁，共75頁。DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（Absorbance）以A260表示，A260

2、是核酸的重要性質，在核酸的研究中很有用處。在230nm處為吸收低谷，RNA鈉鹽的吸收曲線與DNA無明顯區(qū)別。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度計加以定性及定量測定。第6頁，共75頁。第7頁，共75頁。Purity of DNA A260/A280: dsDNA-1.8pure RNA-2.0第8頁，共75頁。DNA或RNA純度的測定對待測樣品是否純品可用紫外分光光度計讀出260nm與280nm的OD值來確定，因為蛋白質的最大吸收在280nm處，因此從A260/A280的比值即可判斷樣品的純度。純DNA的A260/A280應為1.8，純RNA應為2.0。樣品中如含有蛋白及苯酚等，

3、A260/A280比值即明顯降低。不純的樣品不能用紫外吸收法作準確的定量測定。第9頁，共75頁。對于純的核酸溶液，測定A260，即可利用核酸的比吸光系數(shù)計算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系數(shù)是指濃度為1gmL的核酸水溶液在260nm處的吸光率，天然狀態(tài)的雙鏈DNA的比吸光系數(shù)為0.020，變性DNA和RNA的比吸光系數(shù)為0.022。通常以1OD值（260nm）相當于50gmL雙螺旋DNA，或40gmL單螺旋DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸計算。這個方法既快速，又相當準確，而且不會浪費樣品。第10頁，共75頁。1.84第11頁，共75頁。通常，含量：1OD260nm=50mg/ml 雙鏈D

4、NA純度：OD260nm/OD280nm=1.8If OD260nm/OD280nm1.8，Contaminated by ?第12頁，共75頁。第13頁，共75頁。第14頁，共75頁。核酸的大小生物基因組的大小顯花類兩棲類支原體第15頁，共75頁。迄今測出的最小的基因組科學家最近測出的兩個細菌基因組如此之簡單和小，它們也許給自身的定位帶來危機。日本和西班牙的研究小組測定了生活在其它生物內的“共生菌細菌基因組，其中一個可能將喪失它作為真正生物體的地位而成為其宿主細胞的一個部分，另一個看來正在走向滅絕。 Carsonella ruddii是生活在吸食植物液昆蟲身上的一種寄生細菌，它的基因組只有1

5、60個kb之長。過去的估計曾把最小的基因組定在400kb左右。雖然Carsonella基因組排得很滿，有許多重疊的基因，而且?guī)缀鯖]有“廢物”DNA，但是它沒有許多被認為是生命不可缺少的基因。這些發(fā)現(xiàn)提出，Carsonella 也許進化成了昆蟲細胞內的一個細胞器，宿主細胞補償了缺失的基因功能。Buchnera aphidicola的基因組要大一點兒，約為420kb。該細菌與其它幾種細菌一樣共生在一種蚜蟲身上。與其它共生物種相比，B. aphidicola失去了許多能讓它為宿主生存作出貢獻的重要功能，這是好的共生體所需要做到的。其它的共生細菌看起來接管了這些功能。推測B. aphidicola 可

6、能在走向滅絕。第16頁，共75頁。電泳鑒定DNA分子的大小原理帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠化學惰性的介質（瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構型或形狀的差異，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。第17頁，共75頁。凝膠電泳分離生物大分子第18頁，共75頁。Agarose gel electrophoresis第19頁，共75頁。遷移率電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構型的核酸分子，構型緊密的比松散型的開環(huán)DNA分子或線性DN

7、A分子遷移率要快 第20頁，共75頁。DNA分子大小的估計第21頁，共75頁。第22頁，共75頁。核酸構型第23頁，共75頁。凝膠電泳的分辨率： 與凝膠的類型和密度相關 瓊脂糖凝膠的分辨率在0.250Kb之間; 聚丙烯酰胺的分辨率在11000bp之間第24頁，共75頁。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為常熔點的瓊脂糖和低熔點（LMP）瓊脂糖。 第25頁，共75頁。瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： 緩沖液：TAE（TBE、TPE），1 x 凝膠的濃度：根據(jù)檢測的DNA大小，1% DNA樣品：40kb?=40kb?第36頁，共75頁。脈沖電場凝膠電泳（PFGE）1984年，D

8、.R.Cantor發(fā)明的。分離超大分子量的DNA分子。在脈沖電泳中，電場方向是周期變化的，頭一個脈沖電場方向與核酸的移動方向成45 角，下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側成45 角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場方向、電流大小、以及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時調整其泳動的方向，來適應凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構型和方位，使之能夠按新的方向移動，所以遷移率就慢，從而達到了分離大分子量DNA分子的目的。第37頁，共75頁。第38頁，共75頁。第39頁，共75頁。核酸分子雜交鑒定技術核酸分子雜交技術，是

9、在1968年由華盛頓卡內基學院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。 第40頁，共75頁。雜種核酸分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子。DNA/DNA的雜交作用檢測特定生物有機體之間的親源關系。DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某種特定基因的位置。第41頁，共75頁。核酸雜交常用幾種膜的性能比較第42頁，共75頁。硝酸纖維素膜不能滯留小于150bp的DNA片段。應用

10、1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對小片段DNA的滯留能力。RNA變性后能十分容易的結合到膜上。第43頁，共75頁。 尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉移：通常利用毛細作用將核酸樣品轉移到固體支持膜上。 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標記的DNA/RNA進行雜交。第44頁，共75頁。Southern Blot DNA印跡雜交根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E

11、.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫Southern DNA 印跡轉移技術。 第45頁，共75頁。 印跡轉移前的凝膠處理：分子量不同所需轉移的時間不同；浸泡在0.25M的HCL溶液中脫嘌呤，再進行 堿變性 堿水解，DNA鏈斷裂 單鏈第46頁，共75頁。（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern 凝膠轉移雜交技術第47頁，共75頁。Southern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G

12、-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。第48頁，共75頁。 在進行核酸印跡轉移的時： 1.要將已轉移好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤12小時； 2.紫外線交聯(lián)法，DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯(lián)。 第49頁，共75頁。Northern Blot印跡技術1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種

13、實驗方法。由于這種方法與Southern DNA印跡雜交技術十分類似，所以叫做Northern RNA印跡技術（Northern blotting）。而將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質之抗體進行反應，這種技術叫做韋斯頓蛋白質雜交技術（Western blotting）。第50頁，共75頁。斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交（dot blotting）和狹線印跡雜交（slot blotting ）是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的定量化的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。由于在實驗的加樣過程中使用了特殊設計的加

14、樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。這兩項技術更適應與核酸樣品的定量檢測。第51頁，共75頁。通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品,直接轉移到適當?shù)碾s交濾膜上，然后按如同Southern或Northern 印跡雜交一樣的方式同核酸探針分子進行雜交 。第52頁，共75頁。菌落雜交也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。主要用于鑒定重組子。第53頁，共75頁。檢測重組體克隆的菌落雜交技術第54頁，共75頁。蛋白質/DNA、蛋白質

15、/RNA雜交技術第55頁，共75頁。凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）又叫DNA遷移率變動實驗（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。 原理：DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。第56頁，共75頁。凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標記的DNA由于同一種細胞蛋白質B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影*凝膠電泳放射性標記的DNA細胞蛋白質提

16、取物蛋白質與DNA結合*BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合*第57頁，共75頁。凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標記的DNA由于同一種細胞蛋白質B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影*凝膠電泳放射性標記的DNA細胞蛋白質提取物蛋白質與DNA結合*BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合第58頁，共75頁。不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片段結合的蛋白質分子而且可以研究發(fā)生此種結合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）第59頁，共75頁。(a)(b)

17、(c) 在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質結合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。*蛋白質與未標記的競爭DNA結合凝膠電泳放射自顯影蛋白質與標記的探針DNA結合*第60頁，共75頁?？梢蚤g接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。1.用具有已知轉錄因子結合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉錄因子2.在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性

18、能及其轉錄因子結合的影響。第61頁，共75頁。 凝膠阻滯實驗能揭示在體內發(fā)生的DNA與蛋白質之間的相互作用的有關信息，但無法確定兩者結合的準確部位。而DNase足跡實驗可以解決這個問題。第62頁，共75頁。DNase足跡實驗（footprinting assay）是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。第63頁，共75頁。32p1 5 10*1 4 8 10*加入蛋白質X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510A B足跡(a)(c)(b)DNaseI 足跡實驗第64頁

19、，共75頁。如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。第65頁，共75頁。硫酸二甲酯（DMS）足跡實驗：DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶會對甲基化的G殘基作特異的化學切割。 而與蛋白結合的DNA片段上的G殘基，不會被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在這些G殘基末端的DNA片段，出現(xiàn)了空白區(qū)。第66頁，共75頁。甲基化干擾實驗（methyltion inter

20、ference assay）根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設計出了另一種研究DNA與蛋白質相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。DMS化學干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。 第67頁，共75頁。GGGGGGmGGGmGGGmGGGmGGGmGGGmDNA局部甲基化與蛋白質提取物混合與蛋白質結合不與蛋白質結合與蛋白質結合凝膠電泳與蛋白質結合的DNA帶含有和兩種類型DNA片段不能與蛋白質結合的DNA帶含有全部三種類型