EB病毒血清抗體檢測(cè)在鼻咽癌早期診斷中的應(yīng)用課件

1、EB病毒血清抗體檢測(cè)在鼻咽癌早期診斷中的應(yīng)用中山市腫瘤研究所 程偉民第1頁(yè)，共41頁(yè)。幾個(gè)基本概念EB病毒抗體及其檢測(cè)方法鼻咽癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估總結(jié)第2頁(yè)，共41頁(yè)。幾個(gè)基本概念EB病毒抗體及其檢測(cè)方法鼻咽癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估總結(jié)第3頁(yè)，共41頁(yè)。EB病毒1964 年Epstein 和Barr 首次成功地將Burkitt 非洲兒童淋巴瘤細(xì)胞通過(guò)體外懸浮培養(yǎng)建立病毒株，并在該病毒株細(xì)胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，命名為EB 病毒( Epstein-Barr virus ,EBV) 。EB病毒屬于人類(lèi)皰疹病毒，是一種人類(lèi)普遍感染的嗜B淋巴細(xì)胞病毒。在急性感染階段，EB病毒初次感染發(fā)生于口咽鱗

2、狀上皮細(xì)胞，其后可長(zhǎng)期存在于B淋巴細(xì)胞，呈潛伏感染狀態(tài)。由于靜止?fàn)顟B(tài)的EB病毒一旦處于活化狀態(tài)，即可變?yōu)榕c包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的相關(guān)病因，因此EBV被IARC（1997）列為第一類(lèi)人類(lèi)致癌病毒。第4頁(yè)，共41頁(yè)。EB病毒EBV 與多種人類(lèi)惡性腫瘤有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)EBV 除引起B(yǎng)urkitts 淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤;鼻咽癌;NK/ T 淋巴細(xì)胞瘤;平滑肌肉瘤及胃、乳腺、肺等部位的惡性上皮腫瘤。第5頁(yè)，共41頁(yè)。EBV 是一種嗜B 細(xì)胞的人類(lèi)皰疹病毒，在B 細(xì)胞中有兩種感染形式：1、增殖性感染 EBV 感染B細(xì)胞后，僅極少一部分病毒基因在細(xì)胞中能充分地表達(dá)。首先合成EA (早期抗原) 等

3、早期基因產(chǎn)物，接著是DNA 復(fù)制、VCA (莢膜蛋白) 和MA (膜抗原) 合成，最后組成完整的病毒顆粒而釋放，此時(shí)細(xì)胞亦隨之溶解而死亡。EBV感染細(xì)胞的形式第6頁(yè)，共41頁(yè)。2、非增殖性感染 (1) 潛伏感染:EBV 感染B 細(xì)胞后，多數(shù)細(xì)胞中的病毒基因組處于潛伏狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞只合成EBNA 和LMP。根據(jù)EBV 在不同腫瘤中的表達(dá)情況，分為潛伏 型，潛伏型為健康攜帶者。第7頁(yè)，共41頁(yè)。鼻咽癌是我國(guó)南方的多發(fā)腫瘤之一，來(lái)源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的低分化或非分化癌。為惡性度較高的腫瘤， NPC有明顯的種族傾向，大部分患者是中國(guó)人及其后裔，在愛(ài)斯基摩人、北非洲人和馬來(lái)人中也較常見(jiàn)。在我國(guó)發(fā)病率以廣

4、東省為最高，其次為廣西、湖南、福建、江西等省。發(fā)病率男性達(dá)30/10萬(wàn)以上，女性也超過(guò)15/10萬(wàn)。鼻咽癌可發(fā)生于各種年齡，以3050歲為發(fā)病高峰，年齡最小3歲，最大90歲。中山是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)發(fā)病率達(dá)萬(wàn)。鼻咽癌第8頁(yè)，共41頁(yè)。EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系EB病毒與鼻咽癌密切相關(guān)；流行病學(xué)調(diào)查也表明，世界上90以上的人群都有EB病毒的感染，在發(fā)展中國(guó)家EB病毒的感染可以發(fā)生在幼年時(shí)期，據(jù)調(diào)查，我國(guó)南方EB病毒的感染最早可出現(xiàn)在4歲。對(duì)于大多數(shù)人來(lái)說(shuō)EBV可以長(zhǎng)期潛伏于體內(nèi)而不引起明顯、嚴(yán)重的后果，但是，對(duì)于部分感染者來(lái)說(shuō)，其體內(nèi)的EBV卻暗示著惡性發(fā)展?；贓B病毒感染的普遍性以及鼻咽癌發(fā)病的地域

5、性和人種傾向性，因此，是否存在與鼻咽癌高發(fā)相關(guān)的EB病毒株是個(gè)很令人感興趣的課題。第9頁(yè)，共41頁(yè)。鼻咽癌患者血清學(xué)特點(diǎn)：1、高抗體水平2、寬抗體譜-多種抗體水平升高血清EB病毒抗體鼻咽癌患者血清EB病毒抗體：VcA IgA/IgG, EA IgA/IgG,EBNA1 IgA/IgG, Zta IgA/IgG第10頁(yè)，共41頁(yè)。幾個(gè)基本概念EB病毒抗體及其檢測(cè)方法鼻咽癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估總結(jié)第11頁(yè)，共41頁(yè)。 眾所周知, 人體感染EB 病毒并成為攜帶者之后, 一般會(huì)引起免疫反應(yīng), 產(chǎn)生抗體。血液中抗體水平如果持續(xù)存在, 則反映潛伏的EB 病毒經(jīng)常被再激活。EB 病毒在反復(fù)再激活的過(guò)程中可能容

6、易發(fā)生基因變異, 從而在鼻咽癌變中起作用第12頁(yè)，共41頁(yè)。EB病毒抗體水平在正常人群與鼻咽癌病人中的分布情況人群EBNA1/IgAzta/IgGEBNA1/IgG 正常人群 4680.6540.4700.7630.4830.7830.293NPC 病人163.2651.761.4080.6721.2490.317t值1.1093.239.09P值0.0010.001 90% 80% 特異度 90%第16頁(yè)，共41頁(yè)。使用涂片的細(xì)胞中EBV的載量難以保證批間的質(zhì)量一致；結(jié)果觀察在一定程度上欠客觀性 采用幾何級(jí)數(shù)的滴度指標(biāo)較粗對(duì)EB病毒感染的特征（NPC主要是潛伏感染）針對(duì)性不強(qiáng)。間接免疫熒光/

7、免疫酶法的不足之處YYYYB95-8Raji血清抗體標(biāo)記抗體第17頁(yè)，共41頁(yè)。PCR檢測(cè)EBV-DNA近年來(lái)有研究證實(shí)可以在NPC患者血清/血漿中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞的EBV DNA Mutirangura 等首次報(bào)導(dǎo)用巢式RT-PCR方法，在31%NPC患者的血漿中檢測(cè)到EBV DNA Lo等用熒光定量PCR方法檢測(cè)NPC患者的血漿中EBV DNA，檢出率達(dá)96%,并在隨后的研究中證實(shí)放療后腫瘤消退的患者血漿中EBV DNA也迅速下降，可用作預(yù)后判斷。采用Real-time定量PCR技術(shù)，利用一對(duì)特異性引物和特異性熒光探針，結(jié)合PCR技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)EBV病毒的定量檢測(cè)，可用于預(yù)后判斷

8、及有希望成為監(jiān)測(cè)NPC治療后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的指標(biāo)。第18頁(yè)，共41頁(yè)。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 采用不同EBV基因工程重組抗原的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑，是近年來(lái)的主要研究集中的內(nèi)容，目前較為成熟的研究主要有：EBNA1 IgA/IgG、Zta IgA/IgG 、VcA-P18- IgA/IgG 。第19頁(yè)，共41頁(yè)。EBNA1 IgA/IgG在診斷鼻咽癌中的價(jià)值 EBNA是EB病毒的潛伏期的抗原，是病毒潛伏感染狀態(tài)必需的蛋白，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持狀態(tài)中起重要作用；目前在國(guó)內(nèi)外逐漸推廣應(yīng)用檢測(cè)EBNA1抗原抗體作為鼻咽癌的血清學(xué)指標(biāo) 。目前用于作為鼻咽癌診斷的EBNA1抗體有： EBN

9、A1/IgA 和EBNA1/IgG,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩者在診斷鼻咽癌的靈敏度和特異性分別是。靈敏度（%）特異度（%）EBNA1/IgA91.991.4EBNA1/IgG89.476.6第20頁(yè)，共41頁(yè)?？箊ta IgA/IgG在診斷鼻咽癌中的價(jià)值 Zta （EB病毒立即反應(yīng)蛋白）由BZLF1基因編碼，是少數(shù)鼻咽癌細(xì)胞中的EB 病毒由潛伏性感染轉(zhuǎn)化為溶解性感染立即早期時(shí)相的產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)病毒進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)的關(guān)鍵。zat一開(kāi)始表達(dá)，病毒就開(kāi)始進(jìn)入復(fù)制的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程，有報(bào)道認(rèn)為血清zat抗體的檢測(cè)是NPC治療及預(yù)后觀察的一個(gè)很好指標(biāo) 。目前用于作為鼻咽癌診斷的zat抗體有： Zta /IgA 和Zt

10、a /IgG我們實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示Zta/ IgG的靈敏度是81.2特異性是84.0。第21頁(yè)，共41頁(yè)。VcA-P18-IgA/IgG在診斷鼻咽癌中的價(jià)值 VCA 是EB病毒進(jìn)入溶解期主要表達(dá)的抗原之一，與EB 病毒的形成是一致的, 是出現(xiàn)較晚的抗原。大量的研究證明VCA IgA檢測(cè)是鼻咽癌的診斷和預(yù)后觀察的一個(gè)很好的指標(biāo)。目前用于作為鼻咽癌診斷的VCA抗體有： VCA /IgA 和VCA /IgG第22頁(yè)，共41頁(yè)。ELISA檢測(cè)血清EB病毒抗體EBV血清抗體靈敏度特異度VCA-p18-IgA0.706 0.705 VCA-p18-IgG0.530 0.530 EBNA1-IgA0.81

11、2 0.811 EBNA1-IgG0.812 0.796 Zta-IgA0.753 0.758 Zta-IgG0.882 0.880 胡維維、宗永生中國(guó)腫瘤臨床2006 年第33 卷第14 期第23頁(yè)，共41頁(yè)。ELISA檢測(cè)血清EB病毒抗體靈敏度（%）特異度（%）EBNA1 IgA91.991.4EBNA1 IgG89.476.6Zta IgG81.284.03 ELISAs combined90.691.4Two-stage ELISA91.996.5文章發(fā)表在2001年中國(guó)免疫學(xué)雜志第24頁(yè)，共41頁(yè)。 過(guò)往的研究表明，IgA類(lèi)抗體比IgG類(lèi)抗體更能提示鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)性； 而EBNA1 是

12、潛伏性感染的EB 病毒持續(xù)表達(dá)的產(chǎn)物， Zta 是少數(shù)鼻咽癌細(xì)胞中的EB 病毒由潛伏性感染轉(zhuǎn)化為溶解性感染立即早期時(shí)相的產(chǎn)物， VCA 與EB 病毒的形成是一致的，是出現(xiàn)較晚的抗原； 關(guān)于哪種抗體能夠更好的運(yùn)用于臨床篩查鼻咽癌， 已經(jīng)有很多的研究報(bào)道。胡維維等報(bào)道首選Zta-IgG或EBNA1-IgA；顧耀亮等的研究表明，單項(xiàng)以選擇EBNA1-IgA較好；我們實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果顯示EBNA1-IgA的靈敏度和特異度較高。第25頁(yè)，共41頁(yè)。EBNA1/IgA在人群中篩查鼻咽癌正常人群與鼻咽癌人群在各血清學(xué)分層中的分布血清學(xué)分層rOD正常人鼻咽癌病人陰性rOD 1.857.44%77.88%文章在中國(guó)

13、腫瘤臨床發(fā)表第26頁(yè)，共41頁(yè)。多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌2001年我們與香港大學(xué)聯(lián)合在“International Cancer”中首先提出了聯(lián)合多中抗體評(píng)估鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)的觀點(diǎn)。 2005年Chen JKC等在世界衛(wèi)生組織腫瘤分類(lèi)一書(shū)中指出，在血清學(xué)診斷鼻咽癌時(shí)，最好合并采用多種抗體。第27頁(yè)，共41頁(yè)。血清多種抗體聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度抗體組合靈敏度特異度Zta IgG+/EBNA1 IgG+0.7060.977Zta IgG+/EBNA1 IgA+0.7290.962EBNA1 IgG+/Zta IgA+0.6230.962EBNA1 IgA+/Zta IgA+0.6350.902Zta Ig

14、G+/EBNA1 IgA+/EBNA1 IgG+0.6120.992Zta IgG+/EBNA1 IgG+/Zta IgA+0.60.992Zta Ig+G/EBNA1 IgG+/Zta IgA+ 0.5530.985Zta IgG+/EBNA1 IgA+/Zta IgA+0.6230.954第28頁(yè)，共41頁(yè)。幾個(gè)基本概念EB病毒抗體及其檢測(cè)方法鼻咽癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估總結(jié)第29頁(yè)，共41頁(yè)。15年研究的結(jié)果 開(kāi)展人群篩查對(duì)鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)有重要的作用，早期鼻咽癌的發(fā)現(xiàn)，對(duì)提高五年生存率有決定意義 由于鼻咽癌治療 5 年生存率長(zhǎng)期徘徊在5060左右 ，鼻咽癌的早期診斷和治療是提高患 者生存率

15、、改善生存質(zhì)量的重要手段之一。而且鼻咽癌早期癥狀不明顯、原發(fā)部位隱蔽、不易發(fā)現(xiàn)、病程發(fā)展迅速 ，因此尋找敏感性高、特異性強(qiáng)以及安全、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的早期診斷方法是急待解決的課題。第30頁(yè)，共41頁(yè)。血清學(xué)檢查在早期診斷鼻咽癌腫的作用 門(mén)診、篩查、隨訪和陰性組臨床分期分期門(mén)診組 篩查組陽(yáng)性隨訪組陰性組例 % 例 % 例 %例 %I138 9.630 61.222 44.0 7 14.8II726 50.613 26.521 42.019 33.3III521 29.3 5 10.2 6 12.022 42.6IV150 10.5 1 2.1 1 2.0 6 9.3合計(jì)1535 100.0 49 10

16、0.050 100.054 100.0文章發(fā)表在2003年腫瘤第31頁(yè)，共41頁(yè)。血清學(xué)檢查在早期診斷鼻咽癌中的作用篩查與隨訪檢出的患者五年生存率分別為75.0%、81.4%，與陰性組病例(臨床分期與門(mén)診組無(wú)顯著差異)比較差異顯著。尤其是篩查中發(fā)現(xiàn)的39例無(wú)癥狀鼻咽癌，五年生存率高達(dá)89.7%，10年生存率68.9%。文章發(fā)表在中華耳鼻喉雜志2003第32頁(yè)，共41頁(yè)。EB病毒在反復(fù)再激活的過(guò)程中可能容易發(fā)生基因變異，從而在鼻咽癌變中起作用。被激活的EB病毒可以導(dǎo)致許多種抗體的產(chǎn)生， 各種抗體水平間互相平衡，且此種平衡因人而異， 就會(huì)形成不同的血清抗體譜，因此, 可根據(jù)檢測(cè)不同的EB 病毒抗體

17、水平來(lái)預(yù)測(cè)攜帶者罹患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)。第33頁(yè)，共41頁(yè)。聯(lián)合多種抗體診斷鼻咽癌的意義分組 EB病毒抗體組合*檢測(cè)（期望）陽(yáng)性百分比優(yōu)勢(shì)比EBNA 1/ IgAEBNA 1/ IgG zta /IgG鼻咽癌患者健康人1LLL0.8(0.6)59.3(59.2)0.02LLH5.8 (2.0)14.8 (14.8)0.13LHL1.7 (2.6)8.8 (9.6)0.34HLL3.3 (3.0)10.2 (9.6)0.35LHH6.6(9.9)3.0 (2.4)4.06HLH6.6 (11.4)1.5 (2.4)4.57HHL15.7 (14.8)1.5 (1.6)9.58HHH59.5 (55.7

18、)0.9 (0.4)137.9合計(jì)100100文章發(fā)表在International J of cacer2001第34頁(yè)，共41頁(yè)。陽(yáng)性人群的隨訪（）（）（）或2（）（）正常人群（）868.73.20.9鼻咽癌（）14.91.722.359.5危險(xiǎn)度0.010.1-4.04.5-9.0137.9復(fù)查時(shí)間（年）2110.5鼻咽纖維鏡是是鼻咽活檢是第35頁(yè)，共41頁(yè)。256例健康人罹患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)度的分布聯(lián)合多種抗體評(píng)估鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)度分組血清抗體譜例數(shù)百分?jǐn)?shù)(%）風(fēng)險(xiǎn)度EBNA1 IgAEBNA1 IgGZta IgG高風(fēng)險(xiǎn)(+)(+)(+)10.39 （1/256）137.9中風(fēng)險(xiǎn)(+)(-)(+)23.1 (8/256)0.3-4.5(+)(+)(-)6低風(fēng)險(xiǎn)(+)(-)(-)1396.5 (247/256)0.0-0.3(-)(-)(-)234第36頁(yè)，共41頁(yè)。幾個(gè)基本概念EB病毒抗體及其檢測(cè)方法鼻咽癌早期診斷與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估總結(jié)第37頁(yè)，共41頁(yè)。檢測(cè)血清EB病毒抗體，作為鼻咽癌血清學(xué)診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，ELISA法檢測(cè)血清EB病毒抗體，是近年提出的一個(gè)新的檢測(cè)手段，隨著方法學(xué)的不斷完善，已逐漸受到臨床的重視。 總 結(jié)第38頁(yè)，共41頁(yè)。VCA和EA都是EB病毒溶解期感染的產(chǎn)物，而鼻咽癌組織中只有部分癌細(xì)胞內(nèi)的EB病毒進(jìn)入