分子病理學(xué)技術(shù)進展及臨床應(yīng)用教學(xué)課件

1、分子病理學(xué)技術(shù)進展及臨床應(yīng)用第1頁，共73頁。一、臨床分子病理學(xué)方法1二、當(dāng)前分子病理學(xué)技術(shù)在臨床的實際應(yīng)用三、分子病理學(xué)臨床應(yīng)用存在的問題及對策思考內(nèi)容:第2頁，共73頁。來自臨床的問題第3頁，共73頁。Contemporary Understanding of Carcinogenesis by molecular biologyas our introduction第4頁，共73頁。More than 100 years ago (1830), British physician Thomas Hodgkin discovered a type of Lymphoma with his

2、naked eyes.In the time, obviously Thomas Hodgkin did never know R-S cells in his cases before the microscope available in clinic.第5頁，共73頁。第6頁，共73頁。While at present time, for us, what can be down with our naked eyes rather then with microscope or modern molecular techniques?第7頁，共73頁。The cellular elem

3、ents in lymphoid & hematopoietic tumors are the key to understand and diagnose their diseases.Even more, the molecules in the related cells are the key, especially involved in the development and differentiation of lymphoid & hematopoietic cellsThat is the beginning of our story today.第8頁，共73頁。Under

4、standing of Lymphocyte Development1950s-20101.structure and function of lymphoid tissueGermenal Center(GC)：structure，function，transformationCapsular and afferent lymphaticsCortexCortexMedullaHilusEfferent lymphatic vesselsTrabeculaeMedullary sinusesMedullary cordsG CFollicleThymus-depending zoneSubc

5、apsular sinusReticulum supporting lymphatic tissue第9頁，共73頁。第10頁，共73頁。第11頁，共73頁。Could you recognize the following cellular elements in lymph node?Germinal centerMantle zoneMarginal zoneT-zone第12頁，共73頁。Understanding based on 70s of last CenturyInterfollicle zoneT lymphocyteT lmmunocyteB lmmunocyteLymp

6、hocyte transform in center of FollicleMemory cellPlasma cellParadigm of Lymphocyte transformB lymphocyteFDCB non-cleaved cellB cleaved cellOnly by morphology第13頁，共73頁。CentroblastBlast Immuoblast Macrophage FDCCentrocyteT cell Macrophage FDCGerminal centerDark zoneLight zoneMantle zoneMantle zoneMarg

7、inal zoneProliferation zoneSelected for apoptosisOn-going mutationby morphology and immunotyping considering molecular eventsLennerts Presumption based on 80s of last Century第14頁，共73頁。Update to B-lymphocyte development model in 2000s第15頁，共73頁。B cell differentiation by immuno-markers第16頁，共73頁。B cell

8、differentiation with anatomical sites of various stages第17頁，共73頁。Could you recognize cellular elementsasfollows in lymph node?Germinal centerMantle zoneMarginal zoneT-zone第18頁，共73頁。Understanding of B cell differentiation until 2005 by H Stein第19頁，共73頁。Naive B cellDCSomatic Hypermutation/ Affinity Ma

9、turationClass Switching IGM IgG, IgAMemory B cellPlasma cellApoptosisGerminal CenterV(D)J recombinationApoptosisAntigenDCCentroblastsCentrocytesBone MarrowPost-Germinal CenterBBBBBBBBBTPrecursorB LymphoblastBCL2 IRF4 BBCL2 BCL6 Decreased AffinityT IncreasedAffinityBCL6 No BCR T cell-rich zone Intact

10、 BCR ?IgHVclonal rearrangement somatic hypermutation!第20頁，共73頁。What happen to T cell since it has been less mentioned第21頁，共73頁。The contemporary understanding of B and T cell differentiation 2009-2010Understanding of the lymphocyte differentiation and transformation by multiple approaches inl. morpho

11、logy, immunotyping and molecular means.第22頁，共73頁。Understanding of general carcinogenesis from different patterns of cell & molecular biology第23頁，共73頁。From colonorectal carcinoma, we understand the multi-step of carcinogenesis but linearized.第24頁，共73頁。APCDCCRASRb/P535p16q21q13q14/17p13Suppressgeneonc

12、ogeneoncogeneSuppressgeneAdenomaMalignantCarcinomaMetastasisBasic understanding of molecular carcinogenesis第25頁，共73頁。分子醫(yī)學(xué)視野下的結(jié)直腸癌: 一個病?兩個病?三個病?第26頁，共73頁。Classical Pathology:by morphology with cell-level resolution as Golden Standard more then 100 years.Modern Pathology:MorphologyPhenotyping of cellG

13、enotyping of cellFunction of cells & moleculesLevel of organ-cell by eyes & microscopeSub-cellular levelProteins, Nuclear acids and their reciprocal reactionsWhat we are facing on in Clinical practicing?第27頁，共73頁。Pathology in Personalized MedicineTechnical platforms in post-genomic era:High-throughp

14、ut Gene Expressionarray Protein and antibody arrayProteomics Epigenomic第28頁，共73頁。In this program we have a central focus: how to dig new biomarkers related with human diseases for both diagnosis, prognosis and clinical treatmentImmunohistochemistryMolecular PathologyModern ImmunopathologyGenetic/her

15、editary pathologyPathology related with cell-communicationSome branching of modern clinical pathologies第29頁，共73頁。morphology is like a grand summary of all genetic events in a cell.“Juan Rosai in : Sue Armstrong : A Matter of Life and Death. Dundee UniversityPress -2008第30頁，共73頁。一、臨床分子病理學(xué)常用方法免疫組織化學(xué)基因

16、克隆性重排的檢測FISH及CGH等位基因不平衡分析雜合性缺失（LOH）的檢測微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性（MSI）的檢測For post-graduate programClinical pathology-ZR-201509第31頁，共73頁。（一）免疫組織化學(xué)及其應(yīng)用第32頁，共73頁。免疫組織化學(xué)的相關(guān)理論和技術(shù)免疫組織化學(xué)的工作原理已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合通過化學(xué)反應(yīng)使標記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶， 金屬離子、同位素等，顯示一定的信號（如：顏色）借助顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察其顏色變化，從而在 抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細胞結(jié)構(gòu)第33頁，共73頁。For post

17、-graduate programClinical pathology-ZR-第34頁，共73頁。免疫組織化學(xué)的應(yīng)用范圍及優(yōu)點：應(yīng)用范圍：提高病理診斷準確性對疾病的預(yù)后和治療的意義 激素癌基因蛋白的應(yīng)用對腫瘤增生程度的評價ki-67,PCNA (5)微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在腫瘤分期上的意義 (7)指導(dǎo)腫瘤的治療(8)免疫性疾病的輔助診斷 (9)病原微生物的檢測For post-graduate programClinical pathology-ZR-2014第35頁，共73頁。2常用免疫組織化學(xué)方法：A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法 間接法金銀法PA

18、P和BigBee APAAPABC法EnVision法BT法（CSA：Catalyzed signal amplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000, 1:106第36頁，共73頁。E.ABC法第37頁，共73頁。近年來的新方法:F. EnVision第38頁，共73頁。G.CSA法（Catalyzed signal amplification） BT法第39頁，共73頁。For post-graduate programClinical pathology-ZR-20120910第40頁，共73頁。CSA原理圖CSA法第4

19、1頁，共73頁。H.免疫組化-原位雜交的聯(lián)合應(yīng)用第42頁，共73頁。I.TUNEL-免疫組化在細胞凋亡檢測 中的應(yīng)用凋亡是一個基因調(diào)控、耗能的主動過程，也稱之為程 序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)。凋亡是單個細胞或數(shù)個細胞的死亡，死亡細胞的質(zhì) 膜(細胞膜和細胞器膜)不破裂，不引發(fā)死亡細胞的自溶， 也不引起急性炎癥反應(yīng)。第43頁，共73頁。形態(tài)學(xué)特點：電鏡下，凋亡的細胞皺縮，質(zhì)膜完 整，胞漿致密，細胞器密集、不同程 度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不 一、大小不等的團塊邊集于核膜處， 進而胞核裂解、胞漿多發(fā)性芽突；胞 漿芽突迅速脫落，形成許多凋亡小體（apopto

20、tic bodies）。凋亡小體外 被以胞膜，其胞漿中含有細胞器，核 碎片可有可無。凋亡小體迅即在局部 被巨噬細胞和相鄰的其他細胞(例如上 皮細胞)吞噬、降解。細胞凋亡和細胞 壞死的超微形態(tài)比較。光鏡下，凋亡細胞胞漿濃縮，強 嗜酸性，可有可無固縮深染的核碎片，故有稱之為嗜酸性小體（councilman bodies）。第44頁，共73頁。生化特點：由基因調(diào)控，是耗能的主動過程Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶活化DNA斷裂以核小體為單位DNA電泳呈階梯狀圖譜第45頁，共73頁。TUNEL法檢測凋亡（ Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated

21、dUTP nick-end- labling ）TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記TdT酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn) 移酶（TUNEL）第46頁，共73頁。TUNEL法示意間接法：Digoxigenin-dUTP第47頁，共73頁。TUNEL染色：直接法參照德國寶靈曼公司原位末端標記試劑盒操作手冊，其主要步驟如下：切片脫蠟至水，雙蒸水、PBS液洗；微波處理：切片置于盛有枸椽酸緩沖液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加熱.PBS液洗 5min3次；每張切片滴加20ugml蛋白酶K液，放于濕盒中37孵育15min；切片置于0.

22、3%H2O2-甲醇液中室溫放置20-25min；滴加TUNEL反應(yīng)混合液，37濕盒中孵育60-90min；TUNEL反應(yīng)混合液主要成分：Bio-11-dUTPTdT酶PBS液洗5min3次；滴加鏈霉菌素辣根過氧化物酶液（用PBS液稀釋成1:200）37濕盒中孵育30min，滴加新鮮配制的DAB-H2O2液，鏡下觀察2-10min顯色；自來水充分洗滌；第48頁，共73頁。免疫組化多重標記的應(yīng)用以EnVision方法為例For post-graduate programClinical pathology-ZR-2014第49頁，共73頁。免疫組化多重標記的應(yīng)用在淋巴瘤研究中的應(yīng)用ABC-DAB/

23、SAB-AP-vector blue示： CD30+H/RS細胞表達P53 、BCL-2ABC-DAB/SAB-AP-vector red示：H/RS細胞、T細胞和B細胞的分布情況。TUNEL-DAB/ SAB-AP-vector red示: CD30+H/RS細胞第50頁，共73頁。4免疫組織化學(xué)的質(zhì)量控制及方案設(shè)計41Ab的保存和配制 保存性分裝即用型配制：選最佳點第51頁，共73頁。42正確的設(shè)計和結(jié)果判斷1. 試劑對照確定第一抗體和第二抗體是否具有抗原特異性。其中要確定第一抗 體對陽性組織的最佳稀釋度；第二抗體對組織蛋白的無反應(yīng)性。陰性試劑對照： 用一個陰性試劑替代一抗或控制步驟目的：

24、 用來評價非特異性染色，并較好解釋抗原部位的特異性標記。第52頁，共73頁。For post-graduate programClinical pathology-ZR-2014第53頁，共73頁。2.組織對照陰性組織對照：例如:正常肝組織用于對照HBsAg陽性的肝細胞檢測再者,如果大規(guī)模使用抗體，一張切片的陰性區(qū)，可能就是另一 張切片（不同Ab）的非特異性染色對照。陽性組織對照：有已知的、含目標抗原的樣本目的： 監(jiān)控抗原是否存在；監(jiān)控抗原敏感性是否喪失。組織內(nèi)對照：可以消除不同組織間固定造成的差異，另一個優(yōu)點是可以不使用陽性對照標本。第54頁，共73頁。陰性試劑對照陰性組織對照陽性組織對照組

25、織內(nèi)對照研究組+-+-定位+/-+/-理論預(yù)期實測值非定位意義？For post-graduate programClinical pathology-ZR-20130909第55頁，共73頁。BIGBEE圖第56頁，共73頁。結(jié)果判斷標準由于影響因素很多，如不同廠家生產(chǎn)的同一種抗體特異性和 敏感性的差異、所用的檢測試劑盒特異性和敏感性的差異、技術(shù) 熟練程序以及固定包埋等，其結(jié)果判斷的標準化問題尚難統(tǒng)一。有一些原則必須掌握：陽性細胞定位是否明確，是胞膜、胞漿還是胞核陽性間質(zhì)清晰，無背景著色。陽性細胞要在5%以上，才能定為陽性。參考評價：50% +第57頁，共73頁。5臨床病理學(xué)免疫組化 “套餐

26、”式標記：51臨床病理學(xué)常用“套餐式標記”選用Keratin Vimentin S-100 LCA第58頁，共73頁。方案一第59頁，共73頁。第60頁，共73頁。第61頁，共73頁。方案二第62頁，共73頁。方案三可疑神經(jīng)內(nèi)分 泌腫瘤CgA NSE蛙皮素第63頁，共73頁。方案四第64頁，共73頁。（二）基因克隆性重排的檢測當(dāng)前對腫瘤分子本質(zhì)的共識：惡性腫瘤細胞克隆性增生。 因此，檢測腫瘤細胞的克隆性存在，即可判斷惡性腫瘤。For post-graduate programClinical pathology-ZR-20130909第65頁，共73頁。目前，臨床上IgH和TCR基因單克隆檢測在淋巴瘤的 分子診斷中普遍應(yīng)用B細胞及T細胞抗原受體的多肽鏈及其相關(guān)基因第66頁，共73頁。For post-graduate programClinical pathology-ZR-20130909第67頁，共7