牛腸道疾病的一種新病原鑒定65教學(xué)課件

1、牛腹瀉類疾病概述臨床上牛腸道疾病包括傳染性疾病和非傳染性疾病，病因復(fù)雜，是嚴(yán)重制約我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要的因素。由傳染性因素所致的牛腸道傳染病-腹瀉，其病原多樣，臨床上以嚴(yán)重腹瀉、脫水和高度死亡為特征。常見腹瀉類疾病主要有沙門氏菌病、大腸桿菌病、牛副結(jié)核病、牛彎曲菌病、球蟲病、隱孢子蟲病、牛病毒性腹瀉、牛細(xì)小病毒病、牛輪狀病毒病、牛冠狀病毒病等。1牛沙門氏菌病流行病學(xué)：各種年齡，但幼齡更易感，以26周齡犢牛易感性最高。妊娠可流產(chǎn)?；疾?dòng)物和帶菌者是主要傳染源。一年四季均可發(fā)生。呈散發(fā)或地方流行性。臨床癥狀急性型：突然發(fā)病、高熱（4041）、精神沉郁、食欲廢絕、產(chǎn)奶量下降。不久即開始下痢，糞便

2、呈水樣，惡臭，帶血或含有纖維素絮片。下痢開始后體溫降至正常或略高。病程持續(xù)47天。不經(jīng)治療或治療不當(dāng)死亡率可高達(dá)75%，而經(jīng)治療后，死亡率可降至10%。病牛表現(xiàn)毒血癥癥狀，脫水、消瘦。持續(xù)1014天糞便稀軟，一般需2個(gè)月才能完全康復(fù)。妊娠母牛感染后可發(fā)生流產(chǎn)。犢牛 有些犢牛在生后48小時(shí)內(nèi)開始拒食、臥地，并迅速出現(xiàn)衰竭等癥狀，常于35天內(nèi)死亡。但多數(shù)犢牛則于1014日齡后發(fā)病，體溫升高（4041），24小時(shí)后排出灰黃色液狀糞便，并混有粘液和血絲，通常于發(fā)病后57天內(nèi)死亡，病死率可達(dá)50%。病期延長時(shí)，腕和跗關(guān)節(jié)可能腫大，有的還有支氣管炎和肺炎等癥狀。 2牛大腸桿菌病流行病學(xué)：病原存在于成年牛腸

3、道和周圍環(huán)境。消化道傳染，也可經(jīng)臍帶感染。該病多見于初生犢牛，尤其23日齡犢牛最為易感，故又成為犢牛白痢。臨床癥狀: 潛伏期短，一般為幾小時(shí)至十幾小時(shí)。敗血癥型 產(chǎn)后3天內(nèi)犢牛。病初體溫升高至40，食欲降低或廢絕，隨后腹瀉，很快脫水，數(shù)小時(shí)至1天內(nèi)因急性敗血癥死亡。病死率可達(dá)80以上。病程稍長者，可能并發(fā)臍炎、關(guān)節(jié)炎或肺炎，幸存者生長發(fā)育受阻。腸毒血癥型 生后7天內(nèi)犢牛，通常不出現(xiàn)明顯癥狀突然死亡。有癥狀者則為典型中毒癥狀，如體溫正?；蛏愿?，初期興奮不安，隨后轉(zhuǎn)為沉郁甚至昏迷，然后進(jìn)入瀕死期。死前伴有劇烈腹瀉，排出白色而充滿氣泡的稀糞。腸炎型 710日齡犢牛，體溫升高、食欲減退、喜躺臥，下痢，

4、糞便初呈黃色粥樣，隨后變?yōu)樗畼?、呈灰白色，并混有未消化的凝乳塊、血液、泡沫，有酸敗氣味。后期病犢排糞失禁，尾和后軀染有稀糞。病程長的，可能出現(xiàn)肺炎或關(guān)節(jié)炎。治療及時(shí)，一般可以治愈。如不及時(shí)治療，常因虛脫或繼發(fā)肺炎而死。個(gè)別病例也會(huì)自愈，但以后發(fā)育遲緩。 3牛彎曲菌性腹瀉流行病學(xué)：又名牛冬痢或黑痢，秋冬季節(jié)，出血性下痢。各品種和年齡均可發(fā)病，一般成年牛發(fā)病較重，犢牛則較輕。地方流行性。病后可獲得一定的免疫力。臨床癥狀： 潛伏期為37天，突然發(fā)病，一夜間可蔓延20%牛群，23天可波及80%牛群。病牛排出惡臭水樣稀糞，常帶有血液。體溫、脈搏、呼吸、食欲正常。病情嚴(yán)重者，表現(xiàn)精神萎頓，食欲不振，弓背寒

5、戰(zhàn)，虛弱無力。病程23天，治療及時(shí)，很少發(fā)生死亡。 4牛副結(jié)核流行病學(xué)：副結(jié)核分枝桿菌主要感染牛，特別幼年牛更易感染發(fā)病。病牛和隱性感染牛是傳染源，流行特點(diǎn)是發(fā)展緩慢，病程長、發(fā)病率不高、病死率極高，一旦在牛群中出現(xiàn)則很難根除。懷孕、分娩、泌乳或營養(yǎng)缺乏等因素可促使發(fā)病。臨床癥狀：潛伏期長達(dá)612個(gè)月，甚至更長。有的幼年牛感染，到5歲時(shí)才表現(xiàn)臨床癥狀。病初往往無明顯癥狀，以后癥狀逐漸明顯，出現(xiàn)間歇性腹瀉，逐漸變?yōu)榻?jīng)常性的頑固腹瀉。糞便稀薄，惡臭，可帶有氣泡、粘液和血液凝塊。早期食欲、精神都還正常，以后食欲減退，逐漸消瘦，眼窩下陷，經(jīng)常躺臥，不愿走動(dòng)。皮膚粗糙，被毛粗亂，下頜及垂皮水腫。體溫常無

6、明顯變化。如給予多汁飼料可加重腹瀉癥狀。如腹瀉不止，一般經(jīng)34個(gè)月，最后因腹瀉衰竭而死?；疾∨Ｈ阂虮静〉乃劳雎士蛇_(dá)10%。 5牛球蟲病流行病學(xué)：各品種，2歲以內(nèi)犢牛發(fā)病率較高，死亡率20%40%，而成年牛常呈隱性感染。一般多發(fā)生在4-9月份。潮濕多沼澤草場放牧牛群很易感染。冬季舍飼期間亦可能發(fā)病，主要由于飼料、墊草、母牛乳房被糞污染，使?fàn)倥８腥尽ＥＨ簱頂D和圈舍衛(wèi)生條件差時(shí)會(huì)增加發(fā)病機(jī)會(huì)。不同地區(qū)，不同牛群的球蟲感染率及發(fā)病率不同。臨床癥狀：多見于2歲內(nèi)犢牛，多急性，但也有慢性。急性病期，通常為1015天，個(gè)別12天死亡。病初表現(xiàn)為精神沉郁，被毛松亂，糞便稀薄稍帶血液且具惡臭味。一周后，癥狀加劇

7、，食欲廢絕，消瘦，精神萎靡，喜躺臥，體溫上升到4042，瘤胃蠕動(dòng)和反芻停止，排出帶血的稀糞，其中混有纖維素性假膜，惡臭。病末期糞便呈黑色，幾乎全是血液，體溫下降，在惡病質(zhì)狀態(tài)下死亡。慢性病例，病程長達(dá)數(shù)月，主要表現(xiàn)下痢和貧血，如不及時(shí)治療，亦可發(fā)生死亡。6牛隱孢子蟲病流行病學(xué)：糞-口途徑感染，宿主范圍廣泛；發(fā)病率很高但死亡率差別很大。100日齡以內(nèi)幼畜尤其430日齡犢牛最易感染。國外報(bào)道犢牛(4-17日齡左右)發(fā)病率達(dá)50%以上，國內(nèi)在北京、湖南、河南等省市調(diào)查的感染率為5.3%-40%，牛病程214天，死亡率16%40%。臨床癥狀：食欲下降、腹瀉、脫水是本病的主要特征。若單獨(dú)感染腹瀉可持續(xù)7

8、天以上，繼發(fā)感染或者混合感染則會(huì)出現(xiàn)脫水、酸堿失衡、腹瀉等。犢牛感染最為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)精神沉郁，厭食，腹瀉，糞便帶血和含大量纖維素；發(fā)育遲緩，進(jìn)行性消瘦和減重甚至死亡。其中鼠隱孢子蟲可引起中等程度的腹瀉，小隱孢子蟲可引起水樣腹瀉。7牛輪狀病毒病流行病學(xué)：17日齡內(nèi)新生犢牛?；疾?dòng)物和隱性感染者是主要傳染源。污染的飼料、飲水、墊草及土壤等媒介經(jīng)口傳播。多發(fā)生在晚秋、冬季和早春。寒冷、潮濕、不良衛(wèi)生條件、劣質(zhì)飼料和其他疾病的等均對該病嚴(yán)重程度和病死率影響很大。臨床癥狀：最早病例見于生后12小時(shí)，最遲也在數(shù)周以內(nèi)終止。人工感染潛伏期是1824 小時(shí)。癥狀以突然腹瀉開始，病犢精神萎頓，體溫正?；蚵杂猩?/p>

9、高。若體溫降至常溫以下則是死亡的征兆。厭食和腹瀉，糞便黃白色液狀，有時(shí)帶有粘液和血液。腹瀉時(shí)間延長，則脫水明顯。病死率可達(dá)1050%，死亡的原因多是急性脫水或酸中毒。病程18天。若繼發(fā)感染大腸桿菌則預(yù)后不良，致死率增高。8牛病毒性腹瀉-黏膜病流行病學(xué)：各種年齡都易感、以幼齡牛易感性最高。病牛分泌物、排泄物、血液和脾臟等都含有病毒，主要傳播途徑是消化道和呼吸道，也可經(jīng)胎盤垂直傳播。以冬春季節(jié)多發(fā)。新疫區(qū)急性病例多，病死率可達(dá)90%100%，老疫區(qū)急性病例少，但隱性感染高達(dá)50%以上。臨床癥狀：潛伏期714天。臨床上牛群多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，但小牛癥狀嚴(yán)重。急性型 常見于幼犢，死亡率很高，腹瀉是特征

10、性癥狀，可持續(xù)13周。稀糞呈水樣初期淡黃色，后期常伴有腸粘膜和血液，水樣、惡臭，有大量粘液和氣泡。體溫升高達(dá)4042，流鼻汁、咳嗽、呼吸急促、流淚、流涎、精神萎頓等，以后口腔粘膜發(fā)生糜爛或潰瘍持續(xù)47天，同時(shí)白血球減少。慢性型 出現(xiàn)間歇性腹瀉，病程較長，一般25個(gè)月，病牛被毛粗亂、消瘦，生長發(fā)育受阻，有的出現(xiàn)跛行。妊娠母牛常發(fā)生流產(chǎn)，或產(chǎn)下有先天性缺陷犢牛。最常見的缺陷是小腦發(fā)育不全?；紶俦憩F(xiàn)輕度的共濟(jì)失調(diào)、完全不協(xié)調(diào)或不能站立。有些患牛失明。 9牛冠狀病毒病流行病學(xué)：多見于19日齡乳用犢牛，腸炎嚴(yán)重程度與犢牛日齡、免疫狀況、病毒毒株和感染劑量有關(guān)。常呈地方流行性，發(fā)病牛場常在幾年內(nèi)連續(xù)發(fā)生。

11、消化道和呼吸道是主要傳播途徑。飼養(yǎng)管理差、寒冷、潮濕可促使本病發(fā)生。臨床癥狀：潛伏期短，約為1d左右犢牛腹瀉主要見于710日齡，吃過初乳或未吃過初乳的犢牛均可發(fā)病，前者病情較輕。病初，患犢精神沉郁，吃奶減少或停止，排淡黃色的水樣糞便、內(nèi)含凝乳塊和黏液，嚴(yán)重的可出現(xiàn)發(fā)熱、脫水和血液濃縮。腹瀉持續(xù)36d，大部分犢牛可康復(fù)，如腹瀉嚴(yán)重、治療不適當(dāng)可能死亡。若繼發(fā)細(xì)菌感染，死亡率可超過50。成年奶?？砂l(fā)生血痢，特征為突然發(fā)病，表現(xiàn)腹瀉，便如黑血樣，產(chǎn)奶量急劇下降，同時(shí)出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振，發(fā)病率可達(dá)50100，但死亡率很低。10牛腸道病毒感染流行病學(xué)：牛腸病毒廣泛存在自然界，主要流行腸

12、病毒1型和2型。BEV-1宿主范圍包括人、馬、狗、牛、豬、兔、禽類、鹿、非洲羚羊、水牛、綿羊和山羊；BEV-2的宿主只有家養(yǎng)牛。在國外牛群中，牛腸病毒陽性率高達(dá)到17.6-80%。初生犢牛因飲用初乳導(dǎo)致抗體陽性率非常高。主要經(jīng)過糞口途徑傳播。病毒在宿主的消化道中復(fù)制增殖。病毒對酸性環(huán)境耐受的特性使得病毒能在消化道中長期存活。感染動(dòng)物糞便中存在相當(dāng)高的滴度（105-1011/g）的病毒粒子。臨床癥狀：一般為隱性感染，下痢、肺炎、呼吸道癥狀和乳房炎較為常見。此外，繁殖障礙表現(xiàn)明顯，如子宮內(nèi)膜炎、不孕、流產(chǎn)和死胎。但大多數(shù)情況下，BEV一般為無癥狀感染，不會(huì)導(dǎo)致患畜健康嚴(yán)重受損。試驗(yàn)感染時(shí)，動(dòng)物表現(xiàn)

13、為輕度下痢和輕微呼吸道癥狀。下痢表現(xiàn)為水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)嚴(yán)重的還有鮮血。體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產(chǎn)奶量大幅下降。約兩周后康復(fù)，康復(fù)后大多數(shù)奶牛的產(chǎn)奶量不能恢復(fù)到病前的水平。11牛腸病毒（Bovine Enterovirus）為小RNA病毒科成員。無囊膜，直徑為27-30nm。復(fù)制部位在胞漿，往往可見晶格樣排列的病毒顆粒。被黏膜或糞便包裹的病毒在通常的環(huán)境下對熱穩(wěn)定。對pH3及高鹽環(huán)境耐受，對消毒劑不敏感。12近年來北京部分牛場的產(chǎn)奶牛普遍（約80%）出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀：水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)（10-15%）嚴(yán)重病牛糞便含有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產(chǎn)奶

14、量大幅下降（約30%）。病程兩周左右，康復(fù)后大多數(shù)奶牛產(chǎn)奶量難以恢復(fù)到病前水平，特別是高產(chǎn)奶牛。據(jù)回顧性調(diào)查，該病兩年發(fā)生一次。發(fā)病牛場采樣分離到了一種牛腸道病毒。 13目的意義本研究通過從臨床上嚴(yán)重腹瀉、血性下痢病牛直腸拭子中分離的一株牛腸道病毒2型分離株鑒定過程，介紹一種基于隨機(jī)PCR 的未知病毒鑒定方法，為后期未知病原體分離鑒定奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為牛腸病毒2型感染的診斷和控制提供了科學(xué)依據(jù)。14病料采集和病毒分離采集病牛直腸拭子，按常規(guī)方法處理備用。培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，待細(xì)胞單層生長至80%以上時(shí)，將處理后的病料接種到MDBK，37作用1h，棄病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培

15、養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察記錄細(xì)胞狀況，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)收獲病毒液，并連傳3代制備毒種。15正常細(xì)胞形態(tài)及感染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞病變 正常細(xì)胞16h36h8h病毒分離結(jié)果 40016 1、 蝕斑純化和病毒增殖 利用MDBK細(xì)胞，按照蝕斑純化常規(guī)方法，將分離物進(jìn)行純化。將經(jīng)過三次純化的未知病毒再次接種細(xì)胞單層，37作用1h，棄病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察記錄細(xì)胞病變（CPE）。至CPE出現(xiàn)90%左右，收獲病毒液。連續(xù)傳毒3代后大規(guī)模增殖病毒。 2 、牛腎細(xì)胞（MDBK）TCID50測定 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BK細(xì)胞至單層后，吸棄培養(yǎng)液，分別接種增殖后的原液細(xì)胞毒和

16、10-110-7稀釋病毒液，病毒稀釋液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替病毒液。每孔100l，每組10孔，于CO2培養(yǎng)箱孵育1h。吸棄接種液，每孔加125 l DMEM維持液，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，觀察細(xì)胞病變情況。17 1、病毒濃縮 在收集到的病毒上清中加入5的PEG 6000，4 攪拌過夜（約18 h）。4 10000 rpm離心1.5 h，棄上清。沉淀用TNMC緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM CaCl2，1mM MgCl2）懸浮，于4 50000 rpm離心1 h，棄上清。沉淀用TNMC緩沖液重新懸浮，使其終體積為濃縮前的1%。

17、 2、病毒提純 在25下將CsCl配制成10%、20%、30%、40%、50%、60%密度梯度的勻漿液，用注射器小心吸取濃度最小的溶液加入離心管底，然后將注射器針頭插入離心管底部依次加入較高的各個(gè)濃度（10%-60%），每個(gè)濃度500 l。在離心管頂部加入1ml病毒液。水平轉(zhuǎn)頭4 50000 rpm，離心24 h。收集離心后形成的各區(qū)帶，用TNMC緩沖液稀釋10或15倍，4 50000 rpm離心1.5 h，以去除殘余CsCl。18病毒提純結(jié)果未知病毒細(xì)胞毒TCID50=10-4.05/0.1ml。病毒液經(jīng)過增殖、濃縮、氯化銫密度梯度離心，獲得4條區(qū)帶。19病毒的理化特性鑒定電鏡照片1 病毒核

18、酸型鑒定2耐酸性試驗(yàn)4胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)5耐熱性試驗(yàn)6脂溶劑敏感性試驗(yàn)320電鏡樣品制備方法 將未知病毒液接種已長成單層的MDBK細(xì)胞，并以維持液維持；16h后將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用PBS（pH7.2， 0.1M）輕輕洗滌一遍；以0.25的胰酶消化細(xì)胞，使之成為單細(xì)胞懸液；1000-3000rpm離心10min，棄去上清；以2.5的戊二醛(PH74)前固定。用刮匙將樣品取出并割成小塊，PBS（pH7.2， 0.1M）洗滌20min；1%鋨酸固定；PBS（pH7.2， 0.1M）洗滌20min；丙酮脫水（梯度30%，50%，70%，80%，90%，100%）每個(gè)梯度20min，脫三遍；環(huán)氧樹脂包埋

19、聚合；切片機(jī)超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色；透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。21電鏡形態(tài)觀察電鏡形態(tài)觀察結(jié)果電鏡照片圖組1電鏡照片圖組222病毒核酸型鑒定 DNA抑制劑如5-氟尿嘧啶等進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生磷酸化，參與新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，產(chǎn)生無功能的分子，從而抑制DNA的合成，將此藥物加于細(xì)胞培養(yǎng)物中，對DNA病毒有明顯的抑制作用，而對RNA病毒沒有或僅有極低的抑制作用。23病毒核酸型鑒定試驗(yàn)方法 在6孔板內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞至單層，稀釋病毒液，使其分別為10010-5六個(gè)稀釋度。向1-6號(hào)板中分別加入100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5六個(gè)滴度的病毒液，7號(hào)板加入DMEM（病毒稀

20、釋液），每孔500 l。在37 CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。用PBS洗滌6孔板，每塊板的三個(gè)孔加入含50 g/ml 5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM維持液，另三個(gè)孔加入不含5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM維持液。置于37 CO2培養(yǎng)箱中孵育3d。按時(shí)觀察細(xì)胞病變。24病毒核酸型鑒定試驗(yàn)結(jié)果接毒后隨著時(shí)間的推移，1-6號(hào)板接毒孔相繼出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變程度隨著稀釋倍數(shù)增大而減弱，6號(hào)板細(xì)胞病變不明顯。每塊6孔板（接種同一稀釋度病毒液）中，添加含5-氟尿嘧啶的維持培養(yǎng)液孔與不添加5-氟尿嘧啶的維持培養(yǎng)液孔相比，細(xì)胞病變出現(xiàn)時(shí)間及病變程度無顯著差異。7號(hào)板（不接病毒）中，所有培養(yǎng)孔均未出現(xiàn)細(xì)胞病變。根

21、據(jù)5-氟尿嘧啶對未知病毒的抑制滴度小于一個(gè)對數(shù)，可以判定未知病毒對DNA抑制劑不敏感，為RNA病毒。25脂溶劑敏感性試驗(yàn) 某些病毒具有囊膜，脂質(zhì)是其重要的結(jié)構(gòu)成分，應(yīng)用乙醚等有機(jī)溶劑除去脂質(zhì)，將使這類病毒滅活，例如皰疹病毒、正粘病毒、副粘病毒和批膜病毒等。故脂溶劑敏感試驗(yàn)可檢測出病毒是否具有囊膜。26脂溶劑敏感性試驗(yàn)方法 于病毒液中加入AR級氯仿，使其終濃度為4.8%，置4振蕩混合10min。500rpm離心沉淀5min，吸取上層液體，滴定病毒感染力。另外，以加入4.8%量PBS的病毒液作為對照，同樣處理和滴定。氯仿處理病毒液的滴度比對照病毒液下降2個(gè)對數(shù)以上者，判斷對氯仿敏感。滴度相差小于1

22、個(gè)對數(shù)者，判為對氯仿不敏感。27脂溶劑敏感性試驗(yàn)結(jié)果將病毒經(jīng)過氯仿處理后接種MDBK細(xì)胞， 細(xì)胞毒TCID50=10-4.02/0.1ml。與未用氯仿處理的病毒的TCID50（10-4.05/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個(gè)對數(shù)，故判定未知病毒對氯仿不敏感，為無囊膜病毒。28耐酸性試驗(yàn) 某些病毒耐酸，例如小RNA病毒科中的腸道病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒卻對酸敏感。因此耐酸性試驗(yàn)也是病毒鑒定上一個(gè)比較重要的項(xiàng)目。29耐酸性試驗(yàn)方法 將病毒液等量分裝于15ml離心管中。用0.1N的HCl將小瓶中的病毒液的pH調(diào)至3.0，并向另1個(gè)離心管內(nèi)的病毒液加入相同于用酸量的滅菌的PBS做對照。置

23、于37的恒溫水浴鍋或者室溫感作1h，再用5.6%NaHCO3溶液將PH調(diào)回至7.2左右。此后將兩瓶病毒液分別用敏感細(xì)胞測定感染力。如果試驗(yàn)組感染力比對照組感染力降低2個(gè)對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒對酸敏感。滴度相差小于1個(gè)對數(shù)者為耐酸。30耐酸性試驗(yàn)結(jié)果將病毒液經(jīng)過HCl處理，再用NaCO3將pH調(diào)回至7.2后接種MDBK細(xì)胞，細(xì)胞毒TCID50=10-4.17/0.1ml。與用等量PBS處理的對照組TCID50（10-3.77/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個(gè)對數(shù)，故判定未知病毒對pH3環(huán)境耐受。31胰蛋白酶敏感性試驗(yàn) 灰質(zhì)炎病毒、豬傳染性胃腸炎冠狀病毒等對胰蛋白酶具有較高的抵

24、抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼腸孤病毒和皰疹病毒等卻易被胰蛋白酶滅活。因此，胰蛋白酶試驗(yàn)也常用于一些病毒的鑒定。32胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)方法 于滅菌15ml離心管內(nèi)，加入病毒液500l，再加入溶于pH7.4PBS的1%胰蛋白酶溶液500 l，使胰蛋白酶終濃度為0.5%，充分混合。置37作用1h，隨即加入滅活的犢牛血清4ml，充分混合，終止胰蛋白酶的作用。另取同樣的病毒液500 l，加入pH7.4PBS液500 l，混合和37放置1h后，加入滅活犢牛血清4ml作為對照。最后將上述兩份混合液分別在BK細(xì)胞測定感染力。感染力比對照組降低2個(gè)對數(shù)以上，以至完全喪失感染力者，判為對胰蛋白酶敏感；滴度

25、相差小于1個(gè)對數(shù)者，判為對胰蛋白酶抵抗。33胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果將病毒經(jīng)過胰蛋白酶處理后接種MDBK細(xì)胞，細(xì)胞毒TCID50=10-3.06/0.1ml。與用等量PBS處理的對照組TCID50（10-3.17/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個(gè)對數(shù)，故判定未知病毒對胰蛋白酶不敏感。34耐熱性試驗(yàn) 不同病毒對不同溫度的敏感度以及耐受時(shí)間不同，故可以通過熱敏感性試驗(yàn)及結(jié)合二價(jià)陽離子保護(hù)性試驗(yàn)（二價(jià)陽離子例如MgCl2，能夠明顯提高某些病毒對50-55 高溫處理的抵抗力）對病毒進(jìn)行鑒定。35耐熱性試驗(yàn)方法 1、對不同溫度的耐受 將病毒懸液分為等量4管，分別置于50、60、70、80水浴1h，測

26、定感染力。如果在某個(gè)溫度下試驗(yàn)組感染力比對照組感染力降低2個(gè)對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒對此溫度敏感。滴度相差小于1個(gè)對數(shù)者為耐受。 2、對50的耐受時(shí)間 將病毒懸液分為等量4管，置于50水浴分別感作5、10、15和30min，隨后測定感染力。如果試驗(yàn)組感染力比對照組感染力降低2個(gè)對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒在此時(shí)間內(nèi)對50敏感。滴度相差小于1個(gè)對數(shù)者表明病毒在此時(shí)間內(nèi)對50耐受。 36耐熱性試驗(yàn)方法3、二價(jià)陽離子保護(hù)性試驗(yàn) 將MgCl2用蒸餾水配成1.1M溶液。另將病毒液分成兩份，分別用1.1M MgCl2溶液和生理鹽水（對照）作10稀釋，置50水浴感作1h后，在細(xì)胞培養(yǎng)物上

27、滴定感染力，如果試驗(yàn)組感染力比對照組感染力提高2個(gè)對數(shù)以上，則證明MgCl2對病毒具備保護(hù)性。滴度相差小于1個(gè)對數(shù)者為不具有保護(hù)性。37耐熱性試驗(yàn)結(jié)果 1、對不同溫度的耐受 分別將經(jīng)過50、60、70、80處理1h的病毒，接種BK細(xì)胞，3天后觀察均不引起細(xì)胞病變，由此可知50作用1h便可滅活病毒。 2、對50的耐受時(shí)間 分別將經(jīng)過50處理5min、15min、30min、1h的病毒，接種BK細(xì)胞，3天后觀察均不引起細(xì)胞病變。由此可知，50作用5min便可滅活裸露狀態(tài)的病毒。 38耐熱性試驗(yàn)結(jié)果 3、二價(jià)陽離子保護(hù)性試驗(yàn) 將MgCl2溶液處理的病毒液置于50水浴1h后接種MDBK細(xì)胞，細(xì)胞毒TC

28、ID50=10-5.06/0.1ml。 與未使用MgCl2溶液且經(jīng)過同樣高溫處理的病毒（完全滅活）相比較，可以判定MgCl2溶液對處于50高溫環(huán)境中的未知病毒具有保護(hù)力。 39理化特性鑒定總結(jié)病毒核酸型鑒定RNA（抑制滴度小于一個(gè)對數(shù) ）脂溶劑敏感試驗(yàn)無囊膜（TCID50：10-4.02/0.1ml VS 10-4.05/0.1ml） 胰酶敏感試驗(yàn)不敏感（TCID50：10-3.06/0.1ml VS 10-3.17/0.1ml） 耐酸性試驗(yàn)pH3耐受（TCID50：10-4.17/0.1ml VS 10-3.77/0.1ml） 耐熱性試驗(yàn) 50作用5min滅活（TCID50：100/0.1m

29、l VS 10-4.05/0.1ml） 二價(jià)陽離子具有保護(hù)力（TCID50：10-5.06/0.1ml VS 100/0.1ml） 40排除可疑病毒 結(jié)合病牛癥狀及病毒核酸型，對描述相符的一些常見病毒進(jìn)行檢測排除?？梢圆捎醚鍖W(xué)試驗(yàn)、PCR檢測等方法。41可疑病毒排除試驗(yàn)方法 根據(jù)病毒引起牛腹瀉的臨床癥狀及核酸型判定結(jié)果，懷疑其可能為BVDV（病毒性腹瀉病毒）、BCV（牛冠狀病毒）、BRV（牛輪狀病毒）感染。故合成這三種病毒的特異性引物對病毒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下： （1）BVDV引物 FBVDV：5-CAT GCC CAT AGT AGG AC-3 RBVDV：5-CCA TGT GCC A

30、TG TAC AG-3 （2）輪狀病毒引物 FBCV：5-AgA ATT TCC gTT Tgg CTA-3 RBCV：5-Cgg TCA CAT CAT ACA ACT CT-3 （3）冠狀病毒引物 FBCV：5-gAg CgT CCT TTg gAA ATC gT-3 RBCV：5-gCT TAg TTA CTT gCT gTg gC-342 用BVDV、BCV、BRV特異性引物對未知病毒RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 1. 用BVDV特異性引物對BVDV病毒株擴(kuò)增產(chǎn)物（陽性對照） 2. 用BVDV特異性引物對未知病毒擴(kuò)增產(chǎn)物 3. 用BCV特異性引物對未知病毒擴(kuò)增產(chǎn)物 4. 用BRV特異性引物對未

31、知病毒擴(kuò)增產(chǎn)物 M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 可疑病毒排除結(jié)果（PCR檢測） 擴(kuò)增結(jié)果顯示，可以排除此病毒為BVDV、BCV及BRV。43分子生物學(xué)檢測方法提取RNA（據(jù)理化鑒定結(jié)果）使用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR或者RT-PCR回收目的片段連接T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒測序序列比對分析 44隨機(jī)引物選擇 隨機(jī)引物PCR技術(shù)(random amplied poly morphic DNA，RAPD；arbitranly primed PCR，AP PCR)是由Welsh、Williams于1990年幾乎同時(shí)建立起來的一項(xiàng)DNA多態(tài)檢測技術(shù)。該技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)，利用一系列單一的人工合成的隨機(jī)寡核

32、苷酸鏈為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這一技術(shù)在物種鑒定、動(dòng)植物分類、群體遺傳學(xué)調(diào)查、遺傳性突變基因的篩查、新病毒發(fā)現(xiàn)等方面得到廣泛的應(yīng)用。 本次試驗(yàn)選擇錨定隨機(jī)引物序列如下： RPAdP：5-ggA CTg gCT CgA Tgg CTC NNN NNN N-3 RPAP： 5-ggA CTg gCT CgA Tgg CTC -3分子生物學(xué)檢測45 1. 用錨定隨機(jī)引物對病毒提純后區(qū)帶1的擴(kuò)增產(chǎn)物 2. 用錨定隨機(jī)引物對病毒提純后區(qū)帶2的擴(kuò)增產(chǎn)物 3. 用錨定隨機(jī)引物對病毒提純后區(qū)帶3的擴(kuò)增產(chǎn)物 4. 用錨定隨機(jī)引物對病毒提純后區(qū)帶4的擴(kuò)增產(chǎn)物 M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 回收500

33、bp以上的條帶錨定隨機(jī)引物擴(kuò)增結(jié)果 電泳圖顯示，模板經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增后其片段大小從幾百至幾千個(gè)堿基對不等，產(chǎn)物呈彗尾樣拖帶現(xiàn)象。 46用錨定隨機(jī)引物對重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果回收目的片段連接T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒47重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果 48 選擇部分酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送至公司測序，測序結(jié)果登陸NCBI進(jìn)行比對。結(jié)果表明， 其與Bovine Enterovirus 同源性為68%-78%。其中，與Bovine Enterovirus type 2 strain 3A （complete genome ）同源性最高。 根據(jù)上述結(jié)果，懷疑此病毒可能為BEV-2，故設(shè)計(jì)合成特異性

34、引物對其進(jìn)行擴(kuò)增。 引物序列如下： BEV-2-F：5-ACg gAg TAg Atg gTA TTC CC-3 BEV-2-R： 5-CgA gCC CCA TCT TCC AgA g-3 目的片段約220bp左右。 序列比對結(jié)果49 1-4. 用BEV-2特異性引物對病毒提純后區(qū)帶1至區(qū)帶4的擴(kuò)增產(chǎn)物 5. 用BEV-2特異性引物對未提純病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物 M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果50 用特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對結(jié)果表明，其與Bovine Enterovirus type2 同源性為80%-93%。其中，與Bovine enterovirus type 2 strain W

35、ye 8844 5 UTR同源性最高。 序列比對結(jié)果51結(jié)論病毒特性檢測結(jié)果與牛腸病毒2型的各項(xiàng)理化特性相符。分子生物學(xué)檢測結(jié)果表明，該病毒與牛腸病毒2型分離株同源性高達(dá)93%。結(jié)合以上二者判定未知病毒屬于牛腸病毒2型。52工作正在進(jìn)行中血清學(xué)檢測方法建立血清流行病學(xué)調(diào)查動(dòng)物回歸試驗(yàn)全基因組序列測定防控措施制定和產(chǎn)品研制53Thank you for your attention！54RjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H

36、8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWn

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