臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)：第十七章 補(bǔ)體參與的反應(yīng)及補(bǔ)體測(cè)定

1、第十七章 補(bǔ)體參與的反應(yīng)及補(bǔ)體測(cè)定 補(bǔ)體（complement,C）是存在于正常人及脊椎動(dòng)物血清中的一組與免疫相關(guān)并可被激活的蛋白質(zhì)。它包括近40種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白，所以又稱為補(bǔ)體系統(tǒng)（Complement system）。 在正常生理情況下，多數(shù)補(bǔ)體成分以非活化形式存在，補(bǔ)體主要的激活途徑有：經(jīng)典激活途徑(claasical complement pathway)旁路激活途徑(alterlative complement pathway) 在激活過程中可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，引起機(jī)體的一系列生物學(xué)效應(yīng)。第一節(jié)補(bǔ)體參與的反應(yīng)一、免疫溶血試驗(yàn)二、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 三、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn) 四、

2、免疫粘附試驗(yàn) 一、免疫溶血試驗(yàn)免疫溶血試驗(yàn)的原理是補(bǔ)體能使已被抗體致敏了的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。實(shí)驗(yàn)時(shí)將三者混合，置3730min，如條件適合溶血即可發(fā)生。（一）參與免疫溶血反應(yīng)的試劑1、補(bǔ)體 2、綿羊紅細(xì)胞 3、溶血素 1、補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)室多采用新鮮混合豚鼠血清作為補(bǔ)體的來源。補(bǔ)體在體外極易失活，因此采血后需及時(shí)分離血清，及時(shí)使用，最好在當(dāng)天用完，必須保存時(shí)需小量分裝，置20可保存數(shù)月（避免反復(fù)凍融），如為凍干制品可保存數(shù)年，但其活性都會(huì)有所降低。使用前需滴定其效價(jià)。2、綿羊紅細(xì)胞在免疫溶血反應(yīng)中所用的抗原為綿羊紅細(xì)胞（SRBC）?？捎肁lsever液（主要成分為枸櫞酸鈉、枸櫞酸和葡萄糖）保存于4三周。

3、用前以生理鹽水洗滌三次，配成試驗(yàn)中所用的2%5%的懸液。配制好后在542nm波長(zhǎng)比濁，讀取吸光度，按該吸光度值調(diào)節(jié)每次試驗(yàn)所用的紅細(xì)胞濃度，使之保持一致。3、溶血素即抗綿羊紅細(xì)胞抗體，多數(shù)是兔抗綿羊紅細(xì)胞血清。一般沒有必要用純化抗體，試驗(yàn)前需經(jīng)56、30min滅活補(bǔ)體。由于免疫溶血試驗(yàn)的結(jié)果與所用溶血素的多少有關(guān)，因此在試驗(yàn)前必需用免疫溶血試驗(yàn)滴定溶血素效價(jià)。免疫溶血試驗(yàn)滴定溶血素效價(jià)操作如下（1）稀釋緩沖鹽溶液磷酸緩沖鹽溶液或巴比妥緩沖鹽溶液均可用于免疫溶血試驗(yàn)，pH值的范圍在7.27.4之間，適量的氯化鈉使溶液達(dá)到等滲。為保證補(bǔ)體的活化，在緩沖鹽溶液中還需加入適量的鈣離子和鎂離子。（2）溶

4、血素的稀釋溶血素的效價(jià)一般都比較高，因此稀釋時(shí)需注意稀釋倍數(shù)，防止單位跨度太大，不利于效價(jià)的確定?？刹捎媒徊娴缺断♂尫ǎ磧扇齻€(gè)等倍稀釋系列交叉進(jìn)行。（3）溶血素的效價(jià)滴定將不同稀釋度的溶血素和等量的補(bǔ)體及綿羊紅細(xì)胞混合于試管中，37水浴30min后觀察。完全溶血的試管中液體紅色透明，離心后無細(xì)胞沉降。完全不溶血的試管中液體渾濁，離心后紅細(xì)胞完全沉降，上清液無色透明。不完全溶血的情況介于二者之間。按以上標(biāo)準(zhǔn)，以產(chǎn)生完全溶血的溶血素的最高稀釋度作為溶血素的效價(jià)，確定為一個(gè)單位（unit）。在試驗(yàn)中一般采用個(gè)單位的溶血素，如：溶血素的效價(jià)為1：3000，配制個(gè)單位的溶血素需將溶血素作1：1500稀

5、釋。 （二）免疫溶血試驗(yàn)的用途1.溶血空斑試驗(yàn)是用已知SRBC和補(bǔ)體檢測(cè)SRBC免疫小鼠脾細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的抗SRBC抗體；2.CH50試驗(yàn)是用已知SRBC和溶血素檢測(cè)血清總補(bǔ)體溶血活性。3.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是以溶血試驗(yàn)作指示，即用已知SRBC和溶血素檢測(cè)補(bǔ)體是否被消耗，從而判定抗原抗體的對(duì)應(yīng)情況。4.抗補(bǔ)體試驗(yàn)也是以溶血試驗(yàn)作指示，檢測(cè)血清中有無能結(jié)合補(bǔ)體的免疫復(fù)合物。二、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)原理 技術(shù)要點(diǎn) 方法評(píng)價(jià) （一） 原理 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test, CFT）是利用抗原抗體復(fù)合物可結(jié)合補(bǔ)體，而游離的抗原或抗體不能結(jié)合補(bǔ)體的特點(diǎn)，以溶血素和綿羊紅細(xì)胞這一對(duì)抗原

6、抗體系統(tǒng)作為指示系統(tǒng)，用已知抗原（或抗體）檢測(cè)未知抗體（或抗原）的試驗(yàn)。在試驗(yàn)中有三個(gè)系統(tǒng)參與反應(yīng)指示系統(tǒng)即溶血素及綿羊紅細(xì)胞，試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，形成致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitized sheep RBC，SSRBC）；補(bǔ)體反應(yīng)系統(tǒng)即已知的抗原（抗體）和待測(cè)的抗體（抗原）。（二） 技術(shù)要點(diǎn) SRBC濃度固定在1%2%。其他成分如溶血素，補(bǔ)體，抗原及抗體等均需事先滴定其單位，配制成特定的濃度，以保證結(jié)果的可靠性。在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，待檢血清使用前應(yīng)預(yù)先滅活補(bǔ)體。試驗(yàn)用2U溶血素。 1、抗原和抗體的滴定 抗 原抗 體 抗原對(duì)照1：81：161：321：641：1281：80000141：160

7、001241：320001241：640002341：128234444抗體對(duì)照444444表17- 抗原抗體方陣滴定結(jié)果示例抗原的效價(jià)為1：64，抗體的效價(jià)為1：32，以此稀釋度為1u。正式進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，所用的抗原量為2u4u，抗體量為4，在本例中抗原采用1：161：32稀釋度，抗體采用1：8稀釋度。2、補(bǔ)體滴定補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)前需滴定補(bǔ)體效價(jià)。按表17-2依次加入1：30稀釋的補(bǔ)體，緩沖鹽溶液，2個(gè)單位的抗原于試管中，混勻后，37水浴30min，再加入致敏羊紅細(xì)胞，再置3730min。溫育結(jié)束后觀察結(jié)果，以引起完全溶血的補(bǔ)體最少用量作為1個(gè)單位（1u）。表17-2 補(bǔ)體滴定管號(hào)1：30補(bǔ)

8、體（ml）緩沖鹽溶液（ml）2單位的抗原（ml）1%致敏羊紅細(xì)胞ml假定結(jié)果0.060.240.1 370.2 370.080.220.1 水浴0.2 水浴+0.100.200.130min0.230min+0.120.180.10.2+0.140.160.10.2+0.30.10.2如表17-2所示結(jié)果，1：30的補(bǔ)體0.12ml為1u，2u則為1：30補(bǔ)體0.24ml。正式試驗(yàn)中采用2的補(bǔ)體，補(bǔ)體用量為0.2ml，需對(duì)補(bǔ)體的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算，30 ：X=0.24 ：0.2，X=25，則將補(bǔ)體原液作1：25稀釋后，每0.2ml即含有2u的補(bǔ)體。3、正式試驗(yàn)將已滴定好的補(bǔ)體，已知抗原（或抗體）

9、等按試驗(yàn)要求配成一定濃度，與緩沖鹽溶液及待檢樣品依次加入試管中，同時(shí)設(shè)置一系列對(duì)照。37水浴60min或41618h后，再加入配好的致敏紅細(xì)胞，置37水浴30min。溫育完成后觀察結(jié)果。 表17-3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)管號(hào)待檢樣品(ml)抗原（ml）補(bǔ)體（ml）緩沖鹽溶液ml致敏紅細(xì)胞(ml)待測(cè)管0.10.10.2370.237待測(cè)血清對(duì)照0.10.20.1水浴0.2水浴抗原對(duì)照0.10.20.160min0.230min補(bǔ)體對(duì)照（2u）0.10.20.1或0.2補(bǔ)體對(duì)照（1u）0.10.10.240.2補(bǔ)體對(duì)照（0.5u）0.10.050.2516-18h0.2致敏紅細(xì)胞對(duì)照0.40.2（三）

10、方法評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：如靈敏度較高，特異性較強(qiáng)，可檢測(cè)多種類型的抗體或抗原，并可測(cè)定其效價(jià)，試驗(yàn)不需特殊儀器，易于在基層單位普及等。缺點(diǎn)：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)參與反應(yīng)的成分較多，影響因素復(fù)雜，操作手續(xù)繁瑣且要求嚴(yán)格，容易發(fā)生失誤導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果的出現(xiàn)。三、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)complement dependent cytotoxicity, CDC原理：帶有特異抗原的靶細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體參與下，靶細(xì)胞膜被損傷，靶細(xì)胞死亡，染料進(jìn)入細(xì)胞而著色。靶細(xì)胞被殺傷的情況多用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。利用CDC試驗(yàn)可以檢查HLA抗原，也可用于檢測(cè)鑒定HLA的細(xì)胞毒抗體。在試驗(yàn)中抗原靶細(xì)胞為人淋巴細(xì)胞，抗體為針對(duì)相應(yīng)HL

11、A抗原的抗血清，補(bǔ)體為新鮮兔血清。四、免疫粘附試驗(yàn)抗原抗體復(fù)合物激活補(bǔ)體后，可通過C3b或C4b粘附在具有補(bǔ)體受體CR1的紅細(xì)胞、血小板或某些淋巴細(xì)胞上，形成較大的聚合物。利用這一原理設(shè)計(jì)的免疫粘附試驗(yàn)（immune adherence test），可用于檢測(cè)抗原或抗體，也可檢測(cè)細(xì)胞上的CR1。第二節(jié) 補(bǔ)體的測(cè)定一、補(bǔ)體活性的測(cè)定 二 、補(bǔ)體含量檢測(cè)一、補(bǔ)體活性的測(cè)定血清總補(bǔ)體溶血活性（complement hemolysis 50%，CH50）的測(cè)定旁路途徑溶血活性（alternative complement pathway 50%，APH50）測(cè)定 C4活性測(cè)定因子溶血活性測(cè)定 （一）血

12、清總補(bǔ)體溶血活性的測(cè)定（CH50實(shí)驗(yàn)）1、試驗(yàn)原理 根據(jù)免疫溶血試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)。當(dāng)紅細(xì)胞與溶血素的量一定時(shí)，在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，溶血程度與補(bǔ)體的量及活性正相關(guān)。但不是一個(gè)直線關(guān)系。以溶血百分率為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的補(bǔ)體含量為橫坐標(biāo)繪圖可得到典型的“S”形曲線。在50%溶血附近，“S”形曲線最陡，接近一條直線。在此范圍內(nèi)補(bǔ)體活性稍有變動(dòng)，溶血程度就有明顯變化，即是以50%溶血作為反應(yīng)的終點(diǎn)比以100%溶血作為終點(diǎn)更為敏感，因而該試驗(yàn)被稱為補(bǔ)體50%溶血試驗(yàn)（complement hemolysis 50%） ，即CH50試驗(yàn)。以引起50%溶血所需的最小補(bǔ)體量為一個(gè)CH50單位，由此可以計(jì)算出待測(cè)血清中總

13、的補(bǔ)體溶血活性，以CH50 KU/L表示。表17-4 血清總補(bǔ)體溶血活性的測(cè)定管號(hào)1：20稀釋的待檢血清（ml）緩沖液（ml）2u溶血素2%SRBC（ml）10.151.350. 50. 520.201.300.50.530.251.250.50.540.301.200.50.550.351.150.50.561.500.50.5溫育完成后，取出試管離心后，選擇溶血程度最接近50%溶血的兩管，在分光光度計(jì)上542nm讀取吸光度，以最接近50%溶血的一管為終點(diǎn)管。以該管的血清用量計(jì)算血清CH50的值：（二）旁路途徑溶血活性測(cè)定（alternative complement pathway 50%

14、，APH50）.測(cè)定原理：正常情況下，涎酸可抑制B因子活性。家兔紅細(xì)胞所含涎酸量低于其他動(dòng)物的紅細(xì)胞，可以激活血清中的B因子，引起旁路途徑活化，導(dǎo)致兔紅細(xì)胞溶解。在紅細(xì)胞量一定時(shí)，在規(guī)定反應(yīng)條件下，溶血程度與血清中參與旁路活化的補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)。與CH50測(cè)定相似，以引起50%溶血所需的最小補(bǔ)體量為一個(gè)APH50單位，可計(jì)算出待檢血清中補(bǔ)體旁路途徑溶血活性，以APH50 KU/L表示。.測(cè)定方法補(bǔ)體活化時(shí)，經(jīng)典途徑需有鈣離子及鎂離子參與，旁路途徑只需鎂離子參與。用EGTA（二乙醇雙醚四乙酸）可以螯合鈣離子，抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑而不影響旁路途徑的活化。測(cè)定中所用的緩沖鹽溶液含有EDTA。兔紅細(xì)胞

15、用枸櫞酸鹽抗凝，緩沖鹽溶液洗滌三次后，配制成0.5%濃度。將待測(cè)血清用緩沖鹽溶液作1：4稀釋后，與其他試劑按表17-5依次加入試管中，混勻，置37水浴30min。同時(shí)配制50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。表17-5 補(bǔ)體APH50測(cè)定管號(hào)1：4稀釋的待測(cè)血清（ml）緩沖液（ml）0.5%兔紅細(xì)胞（ml）10.100.50.420.150.450.430.200.400.440.250.350.450.300.300.46-0.60.4溫育完成后，取出試管離心后，與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管比較，再用分光光度計(jì)確定與50%溶血最接近的一管為終點(diǎn)管。以該管的血清用量計(jì)算血清APH50的測(cè)定值：本試驗(yàn)反映的是補(bǔ)體旁路途徑的溶

16、血活性，其結(jié)果與C3，B因子，P因子，D因子及C5C9各組分的含量及活性均有關(guān)系。（三）C4活性測(cè)定用氨水處理豚鼠血清后可除去其中的C4，由于補(bǔ)體不能依次激活，因此，這種缺少C4的血清（R4）不能使溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞溶血。當(dāng)加入含有C4的待檢血清后，補(bǔ)體連鎖反應(yīng)恢復(fù)，發(fā)生溶血，溶血程度與待檢血清中的C4活性相關(guān)，測(cè)定以50%溶血作為反應(yīng)終點(diǎn)。缺乏C4的抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物（EAR4）的制備在19份新鮮混合豚鼠血清中加入1份14%的氨水，混勻后，置37水浴30min，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至7.2，即可得到缺乏C4的血清（R4），備用。取5%羊紅細(xì)胞懸液與等量4u溶血素混勻，置37水浴30

17、min，即得致敏紅細(xì)胞（EA）。將EA4ml與R4 0.25ml混勻，室溫放置15min即為EAR4。將待檢血清用緩沖鹽溶液作1：150稀釋后，與其他試劑一起，按表17-6依次加入試管中，混勻后，置37水浴30min，同時(shí)配制50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管。正常人血清C4溶血性正常范圍為 8 2702 087 KU/L。表17-6 C4溶血活性測(cè)定管號(hào)1：150待檢血清（ul）緩沖液（ul）EAR4（ul）溶血單位* (KU/L）159510030 0002109010015 000320801007 500430701004 950540601003 7506_100 100 _ （四）因子溶血活性測(cè)定

18、B因子在補(bǔ)體旁路途徑中是一種重要組分，如缺乏B因子將不能使補(bǔ)體旁路活化。將新鮮正常人混合血清56水浴15min即可除去其中的B因子，成為缺乏因子的血清（RB），將RB加入兔紅細(xì)胞，不會(huì)引起兔紅細(xì)胞溶血。如加入含有因子的待檢血清，其中的B因子可被兔紅細(xì)胞激活而使補(bǔ)體旁路途徑重新活化而使兔紅細(xì)胞溶血，溶血程度與待檢血清中的B因子溶血活性相關(guān)。將兔紅細(xì)胞用含有EDTA的緩沖鹽溶液洗滌三次后，配成1%的懸液。以新鮮正常人混合血清作參考血清。按表17-7進(jìn)行測(cè)定。表17-7 B因子溶血活性測(cè)定管號(hào)1：10稀釋RB（ml）1%兔紅細(xì)胞（ml）1:8稀釋待檢血清1：8稀釋參考血清待測(cè)血清管0.60.80.6參考血清管0.60.80.637水浴30min結(jié)束后，取出試管離心，取上清在542nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。以參考血清的A值作100%進(jìn)行換算。待檢血清B因子溶血活性低于60%者判定為B因子溶血活性降低。二 補(bǔ)體含量檢測(cè)常用的方法有單向免疫擴(kuò)散法，火箭免疫電泳，免疫比濁法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及放射免疫分析等。但因各組分血清濃度不等，檢測(cè)方法有所差異。血清含量高的組分如C3、C4、C1q、Bf等可用單向免疫擴(kuò)散法免疫比濁法等測(cè)定。含量低的組分就需用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等靈敏度較高的方法進(jìn)行檢測(cè)