人類疾病石蠟包埋組織收集整理保存技術(shù)

1、中國(guó)人類遺傳資源疾病石蠟包埋組織收集整理保存TechnicalSpecificationfortheParaofChineseDiegeGeneticResources討論稿）技術(shù)規(guī)程ngTissueCollectionandTrimmingonorg.c中國(guó)人類遺傳資源平臺(tái)項(xiàng)目組2005年9月 III石蠟有適當(dāng)硬度，包埋組織能夠常規(guī)制備成36微米厚度的切片用于診斷和研究）由于石蠟包埋組織能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保存組織內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸，用石蠟包埋類疾病組織制作成切片，可用于HE染色分析（通過(guò)鏡下觀察,及RNA的原位雜交分析、蛋白質(zhì)分析、核酸提取用斷或其它分子生物宜的蠟塊儲(chǔ)存環(huán)境、嚴(yán)格培訓(xùn)理診）、DNA

2、學(xué)診斷及研究等。故規(guī)范性地作好石蠟包埋組織、用e非常重要。蠟包埋組織收集整理保存工作的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，為使我目前，我國(guó)尚無(wú)關(guān)蠟塊保管人員，以及明確蠟塊國(guó)相關(guān)工作有章可循，規(guī)范操作和管理，我們根據(jù)目前的研究積累，參考國(guó)際相關(guān)做法，結(jié)合中國(guó)國(guó)情，制定本規(guī)程。org.c 前1234言范圍規(guī)范性引用文件術(shù)語(yǔ)和定義固定后組織的取材、脫水、透明、浸蠟4.44.5取材洗滌脫水透明浸蠟II11c2n2orgene塊存放溫度組織包埋切片、展片及烤片染色封片9.1蠟9.2蠟保管人員的資格及要求蠟塊使用的范圍12蠟塊的醫(yī)療安全規(guī)范參考文獻(xiàn)56782234567888999 人類疾病石蠟包埋組織收集整理保

3、存技術(shù)規(guī)程1范圍本規(guī)程適用于與人體疾病石蠟包埋組織標(biāo)本相關(guān)的診斷、醫(yī)學(xué)及司法科研操作，因此在醫(yī)院、司法機(jī)關(guān)和科研單位應(yīng)規(guī)范執(zhí)行。Qrg用而成為本規(guī)程的條款。凡是注日期的引2規(guī)范性引用文件列文件中的條款通過(guò)本規(guī)程用文件，其隨后所有的修改單（不程達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡件，其最新版本適用于本規(guī)程。誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)程，然而，鼓勵(lì)根是不注日期的.GB/T1.1-2000標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則GB19489-2004生物安全通用要求neorg.c人類疾病固定組織的收集整理保存技術(shù)規(guī)程人類遺傳資源管理辦法n赫爾辛基宣言egISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要

4、求ICD-10WHO國(guó)際疾病分類編碼CNALAC23-2003醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和TX下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1人類疾病石蠟包埋組織資源是指可經(jīng)過(guò)石蠟包埋保存的人體各種疾病組織材料及相關(guān)信息資料。3.2標(biāo)本為了進(jìn)行疾病的臨床診斷、治療及相關(guān)的研究工作，所切取或采集的人體各組織器官的樣本。 3.3固定人體組織固定是采用適宜的固定液充分地固定組織，以便將組織細(xì)胞的固有形態(tài)結(jié)構(gòu)保存下來(lái)，滿足疾病診斷和相關(guān)研究的需要。固定液除了可以固定組織cn4固定后組織的取材、脫水、透明、浸蠟.用r的固定劑,常規(guī)選用之外，還具有硬化組織細(xì)胞的作用。人體新鮮組織的固定要根據(jù)后期不同的用4%中性甲醛液（用

5、緩沖液配制），經(jīng)病理.醫(yī)師取材和標(biāo)記后，將組織依次進(jìn)行沖e明（用二甲苯等）和浸蠟（用石蠟）處理，然后洗、脫水（用遞升濃度的片和染色，制成切片。材和用石蠟將組織4.1取材W.由具有一定經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行組織標(biāo)本的取材。該醫(yī)師應(yīng)熟悉正常和異常w組織大體結(jié)構(gòu)，必須切取到病變組織、正常組織及二者交界組織，大小各為c2cmXl.5cmX0.3cm，同時(shí)完成相關(guān)的記錄，如病理號(hào)、取材部位、組織大小和大體描寫(xiě)等。脫水及透明，并防止染色的組織須流水沖洗約30分鐘，大體描寫(xiě)等。4.2洗滌洗滌的目的是把滲入組織中的固定液洗過(guò)程中福爾馬林色素的產(chǎn)生。經(jīng)常規(guī)固具體時(shí)間依固定時(shí)間長(zhǎng)短e稍有不同。4.3脫水去除

6、組織內(nèi)固有的水分和組織經(jīng)過(guò)固定及洗滌后含有的大量w，于透明劑和石蠟滲入組織?？墒褂妹撍畡┲鸩綄⒔M織塊內(nèi)的水分置換出來(lái)。脫水劑必須是易溶于水的有機(jī)溶劑，常規(guī)使用的有乙醇、丙酮等。由于脫水劑穿透組織的速度很快，常導(dǎo)致組織過(guò)度收縮及變脆，因此必須采用梯度脫水的處理方法，從低濃度開(kāi)始，依次遞增，直至純脫水劑，最終組織內(nèi)部的水分將被高濃度脫水劑所取代。目前，脫水過(guò)程已全部實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，各公司生產(chǎn)的脫水機(jī)型號(hào)和基本原理一樣，具體操作方法及條件設(shè)定請(qǐng)參照脫水機(jī)使用說(shuō)明。整個(gè)脫水過(guò)程在常溫下進(jìn)行： a）乙醇一甲醛（AF）液固定：60120分鐘;b）80%乙醇：60120分鐘；c)95%乙醇1：60120分鐘;

7、d)95%乙醇11：60120分鐘;org無(wú)水乙醇111：3060分鐘；I丿亠未經(jīng)充分固耳彗織不得進(jìn)入脫水程序，用于脫水的試劑容積應(yīng)為組織塊總體積的5g以上b）e脫水必須由低濃度向高濃度逐步過(guò)渡，若組織含水量過(guò)多（如胚胎組，則脫水劑濃度應(yīng)由更低級(jí)（如30%40%乙醇）開(kāi)始;e)f)g)4.3.1a)無(wú)水乙醇1：3060分鐘;無(wú)水乙醇11：3060分鐘;注意事項(xiàng)c）組織脫水要徹底干凈，只有把水分脫去，才能使組織塊在二甲苯中透明，c石蠟才能滲透到脂肪細(xì)胞和組織中去，若脫水不徹底，則切片后組織與空氣接觸即干燥收縮，蠟塊切面組織會(huì)出現(xiàn)凹陷現(xiàn)象。即使勉強(qiáng)切片，染色效果r差o個(gè)重要環(huán)節(jié);且組織于染色時(shí)易脫

8、落。因此脫水徹底與否是制片質(zhì)壞的一時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)促使組織收新舊程度等適當(dāng)增減調(diào)節(jié);縮變硬。脫水時(shí)間要根據(jù)組織塊e）脫水必須在有蓋瓶d）脫水時(shí)間要適當(dāng)，若時(shí)間太短則脫水因高濃度乙醇很易吸收空氣中的水分，陰雨天空氣中濕WfW銅吸收水分。無(wú)水硫酸銅遇水變成藍(lán)色，用后的無(wú)水硫酸銅，經(jīng)高溫干燥后，仍可重復(fù)使用。另一方法是采用磺酸鉀型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸收水分。把吸滿了水的會(huì)影響乙醇的濃度;水乙醇的絕對(duì)無(wú)水。純乙醇中如含有水分，可加入無(wú)水硫酸樹(shù)脂，加溫到150C左右變成干燥的樹(shù)脂，也可重復(fù)使用。4.4透明乙醇等脫水劑不能溶解石蠟，所以在浸蠟之前需要一個(gè)既能與乙醇混合又能溶解石蠟的媒劑，稱為透明劑，以便使石蠟滲入

9、到組織中去。當(dāng)組織中全部為透 明劑占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，此種現(xiàn)象稱為透明。如果組織不能透明，表明脫水不徹底，必須重新脫水補(bǔ)救，否則將影響到浸蠟的進(jìn)行，但重新脫水后的效果往往不好。4.4.1透明效果判定肉眼觀察組織塊呈半透明或透明狀態(tài)即可。.常用的透明劑有二甲苯（xylene）、甲苯o（toluerne）、nzene）、氯仿各類透明劑各有其優(yōu)缺點(diǎn)。4.4.2透明劑(chloroform)和TO型生物對(duì)于人體組織宜a)；20分鐘；二甲苯III：20分鐘。透明：b)1注意事項(xiàng):.4.2.a)b)二甲苯的容積應(yīng)為組織塊總體積的10倍以上;組織塊在二甲苯中透明的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)

10、,以防組織變硬變r(jià)g-C依不同類組織類型和大小而定，一般組織塊呈現(xiàn)棕黃色或暗紅明即可;ned）組織塊經(jīng)二甲苯處理后不顯現(xiàn)透明時(shí)常提示該組織固定或脫水不充分，應(yīng)查找原因并妥善處理。4.5浸蠟.YT組織經(jīng)過(guò)透明后，移入溶化的石蠟溶液內(nèi)這一步驟稱浸蠟（infiltration）,其目的是以石蠟置換出組織塊中的二甲苯使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊，以便切成薄片。浸蠟的方法是將組織塊經(jīng)過(guò)二甲苯透明后，立即投入到c）二甲苯應(yīng)及時(shí)過(guò)濾、更換;溶化的石蠟中去。在浸蠟時(shí)組織必須經(jīng)過(guò)數(shù)次純石蠟處理（石蠟I、II、III），使剩余透明劑完全除盡，否則將影響切片質(zhì)量。根據(jù)熔點(diǎn)的不同，石蠟分為軟蠟和硬蠟。軟蠟熔

11、點(diǎn)低，硬蠟熔點(diǎn)高。一般切片所用的軟蠟熔點(diǎn)為4245C或4550C，硬蠟熔點(diǎn)為5254C或5660C，現(xiàn)在也有6264C的硬蠟，適用于南 方夏天或較堅(jiān)硬的組織。組織較硬時(shí)，用硬蠟，反之，用軟蠟。浸蠟在溫箱中進(jìn)行，箱內(nèi)溫度略高于石蠟熔點(diǎn)23C即可。若箱內(nèi)溫度偏低，石蠟會(huì)凝固，則達(dá)不到浸蠟?zāi)康摹囟冗^(guò)高，浸蠟的組織會(huì)出現(xiàn)收縮變硬，同時(shí)組織中的抗原易n受到破壞，不利于免疫組織化學(xué)等蛋白質(zhì)分析。在更換蠟杯時(shí)，要有一定時(shí)間，盡量減少組織內(nèi)含有的二甲苯被帶入最后的純石蠟杯中，而影響浸org.石蠟I（4550C）：60分鐘；I石蠟II（5658QM0仟鐘；石蠟iii（5|58C）：6分鐘。厲ge化的石蠟必須有

12、專人負(fù)責(zé)，必須在熔蠟箱內(nèi)或水浴中（70C）進(jìn)行,得用明火加溫；人體組織的浸蠟操作宜采用以下步驟：a)b)c)4.5.1a)將透明后.cc）組織塊經(jīng)二甲苯適度透明后方可轉(zhuǎn)入浸蠟過(guò)程，應(yīng)盡可能減少將透明后orod）浸蠟時(shí)間要適當(dāng)。時(shí)間過(guò)短，浸蠟不充分，組織將過(guò)軟；過(guò)長(zhǎng)時(shí)間則組nee）熔蠟應(yīng)定期過(guò)濾、更換。f丄丄egb）熔蠟的容積應(yīng)為組織塊總體積的510倍以上；組織塊表面的二甲苯帶入熔化的蠟中；織變硬、變脆；5組織包埋包埋賈1mb塊的過(guò)程包埋用的石蠟熔點(diǎn)要和浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)相一致；包埋用的石蠟溫度要稍高于浸蠟的溫度。先將熔化的石蠟傾入包埋模具中，再用加熱的彎曲的鈍頭是組織經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟后

13、，再用石蠟鑄成蠟鑷子輕輕夾取已經(jīng)浸過(guò)蠟的組織塊，使組織塊的最大面或特別指定處的組織面向下埋入熔蠟中。要將組織塊平整地置放于包埋模具底面的中央處。一般切面方向朝下放置；管狀、囊壁、皮膚及層次清楚的黏膜應(yīng)立埋；包埋于同一蠟塊內(nèi)的多塊細(xì)小組織應(yīng)彼此靠近；包埋時(shí)應(yīng)使組織急速均勻地凝固，以免石蠟產(chǎn)生白色結(jié)晶導(dǎo)致切片破碎。 注意事項(xiàng)a)應(yīng)將組織塊嚴(yán)格分件包埋，發(fā)生包埋差錯(cuò)時(shí)，必須立即與取材本人取得聯(lián)系，及時(shí)處理。b)必須嚴(yán)防各種異物污染，勿將無(wú)關(guān)組織埋入蠟塊內(nèi)。包埋過(guò)程要操作迅速，以免組織塊于尚未埋妥前熔蠟包埋用的熔蠟使用前應(yīng)先靜置沉淀、o，r純明火，以防燃燒。蠟時(shí)不得使用6切片、展片及烤片ee塊裝在切片

14、機(jī)固定器上，注意調(diào)節(jié)組織塊切面，使之保行。校正切片機(jī)的切片厚度標(biāo)尺，一般46um為宜。調(diào)節(jié)將預(yù)先冷持垂直并與W.的運(yùn)轉(zhuǎn)部分，使組織塊與刀刃接觸，修出組織切面。左手平持毛筆，右手均勻搖轉(zhuǎn)切片機(jī)機(jī)把，切片帶出來(lái)之后，用毛筆輕輕托起，再用眼科鑷子輕攝蠟片，以正面放入展片箱(40C左右熱水)中，待攤平整后，手持清洗好的載玻片之一端投向水中附貼切片，待切片被接引附貼于載玻片上后，再移至玻片切片附貼后，放在空氣中稍晾干，即可進(jìn)行烤片(常規(guī)60C溫箱中烤30丹0min)。干后，才能進(jìn)行烤血塊組織、皮膚組織須及時(shí)烤片；腦組織及較.egea)蠟塊四周在切片時(shí)應(yīng)修切整齊，尤其是上下線，要求平行，否則切片彎片。6.

15、1注意事項(xiàng)曲不直w”刀要鋒利，刀口無(wú)缺損，才能切出完整薄片。若切片刀不夠鋒利,則不能順利連續(xù)切片；切片刀如有缺口，則切片易斷裂、破碎或不完整。c)切片刀及蠟塊都要固定牢靠，組織切片機(jī)各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊，否則將會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)，以致切片厚薄不均。d)搖動(dòng)切片機(jī)時(shí)，用力不能過(guò)猛，應(yīng)保持機(jī)身平穩(wěn)，防止震動(dòng)，否則將導(dǎo)致切片厚薄不均。e)切片刀傾角不宜過(guò)大或過(guò)小，以2030度為佳，角度過(guò)大則切片上卷。 過(guò)小則切片皺起。f)石蠟過(guò)軟或室溫過(guò)高，切片易粘于切片刀上，或發(fā)生皺縮，此時(shí)可將蠟塊置于水槽內(nèi)冷凍后再切。反之，如室溫低或石蠟過(guò)硬，致切不成片時(shí)，塊切面上哈氣加溫。g染色是利用染色劑使組織和細(xì)胞染上不同的顏色

16、，便于顯微鏡觀察。根據(jù)不同的需要可以分成許多種染色，如染色、各類特殊的組織化學(xué)染色、免疫組7染色化染色等；石蠟切片還可以理學(xué)診斷或研究的原位雜交、FISH等。必須有一張HE染色的片子，用于常規(guī)觀察基本無(wú)論后續(xù)將進(jìn)病變并核對(duì)組蒼可木根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定操作程序。在此僅介紹石蠟切片的蘇木精-伊紅(HE)正確。目前許多公司都有各種型號(hào)的染色機(jī)，其基本原理一染色方法。7.1HE染色過(guò)程:a)二甲苯I：510分鐘;b)二甲苯II：510分鐘;c)無(wú)水乙醇I：13分鐘;d)e)無(wú)水乙醇II：13分鐘;95%乙醇I：13分鐘;g：13分鐘;.gwh)i)f)95%分鐘;水：1分鐘;蘇木精液染色

17、：510分鐘;j)流水洗去蘇木精液：1分鐘;k)1%鹽酸乙醇：13秒;l)水洗：12秒;m)返藍(lán)(溫水或1%氨水)：510秒n)流水沖洗：12分鐘; o)蒸餾水：12分鐘;p)0.5%伊紅染液染色：13分鐘;q)蒸餾水稍洗：12秒;r)80%乙醇：12秒;s)t)u)v)w)rg無(wú)水乙醇1：35分鐘；()丄無(wú)水乙醇11：3鄉(xiāng)鐘;無(wú)水乙醇【I：n鐘5分鐘;95%乙醇1：23分鐘;95%乙醇11：23分鐘;zx)y)35分鐘;二甲苯11：35分鐘封片切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固，以利于長(zhǎng)期保存。常規(guī)HEgeneo蠟塊應(yīng)當(dāng)存放在地上(避免在地下室)有通風(fēng)設(shè)施、能承重、空間較大的房年的蠟塊存放。應(yīng)用專

18、門(mén)設(shè)計(jì)的密集柜，蠟塊和相應(yīng)膠封固;其它染色或特殊的分析，按照相關(guān)操作要求進(jìn)行。9蠟塊儲(chǔ)存的環(huán)境及條件9.1蠟塊存放環(huán)境間內(nèi)，至少能保證50100的HE切片要相鄰存放，便于查找與核實(shí)。該空間應(yīng)放有登記簿、顯微鏡、滅火w除蟲(chóng)試劑和相關(guān)設(shè)施。9.2蠟塊存放溫度由于包埋組織的石蠟有一定的熔點(diǎn)，當(dāng)儲(chǔ)存溫度接近該熔點(diǎn)溫度時(shí)，蠟塊就會(huì)變形，從而影響包埋組織。故存放石蠟組織塊的地方，溫度應(yīng)遠(yuǎn)低于包埋石蠟的溫度。但若溫度過(guò)低，石蠟與組織塊之間也容易產(chǎn)生裂隙。一般的蠟塊的儲(chǔ)存溫度應(yīng)在0C40C。蠟塊存放地應(yīng)專人負(fù)責(zé)，保證其衛(wèi)生、安全，特別是要防火、防蟲(chóng)咬、防盜; 蠟塊每次切片后均要將切面用蠟封蓋，避免組織與空氣直

19、接接觸。10保管人員的資格及要求由于蠟塊是人類疾病的個(gè)體不可再生資源，承載著患者疾病形態(tài)學(xué)信息及其組織的蛋白質(zhì)和基因信息，因此蠟塊的保管非常重要，對(duì)保管人員要有扌c高的丄蠟塊保管人員應(yīng)該是熟悉醫(yī)學(xué)知識(shí)（至少0相?中專以上畢業(yè)生），懂得醫(yī)學(xué)資料管理，能做好蠟塊的資料匯編和.索引工作，熟悉蠟塊的制作過(guò)程，蠟塊保存和借閱注意事項(xiàng)，同時(shí)要有e強(qiáng)的醫(yī)學(xué)責(zé)任心，并能嚴(yán)格遵守規(guī)章制度，不向外透露任何患者信息，長(zhǎng)有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的審批，不能外借任何切片和蠟塊，做好完整的蠟塊保管記錄，對(duì)可能發(fā)生的任何相關(guān)事故都有防范措施。.1蠟塊使用的范圍要求。由于蠟塊帶有患者的私人信息，故有一定的私密性，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，未經(jīng)患者同c意不

20、能隨意使用，更不能用于出售或其他商業(yè)目的，合理地使用請(qǐng)參見(jiàn)人類電2or傳資源共享原則。11.1蠟塊的使用范圍包括：切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察a）在醫(yī)療機(jī)構(gòu)，用于患者本人疾病的診n如丿并做出病理診斷；切片做免疫組化附原位雜交、FISH、提取核酸等輔助診斷和協(xié).e2批準(zhǔn)，用于科學(xué)研究，如尋找病因和探索發(fā)病機(jī)制等助臨床治療；等相關(guān)項(xiàng)目b)罕見(jiàn)疾病，或?qū)ξ磥?lái)醫(yī)學(xué)發(fā)展有研究?jī)r(jià)值，納入國(guó)家的資源保存d）在患者同意或要求下，經(jīng)蠟塊保存單位批準(zhǔn)，可進(jìn)行其他合理的使用。12蠟塊的醫(yī)療安全規(guī)范患者的病情等文字資料（含電子信息資料）、非文字資料（組織的石蠟包埋塊、切片等）以及其他相關(guān)資料均為有價(jià)值的醫(yī)學(xué)資料，皆由受理病理學(xué)檢查的病理科按照相關(guān)規(guī)定的期限妥善保存。管理單位必須設(shè)立病理檔案資料室、制定病理 檔案資料管理制度（包括病理檢查資料的歸檔、借用和歸還手續(xù)等）并由專人管理，蠟塊的管理尤為重要。因?yàn)橄瀴K是不可再生的資源，即可有限地復(fù)制切片而進(jìn)行組織化學(xué)、蛋白質(zhì)和核酸研究。蠟塊的丟失將不可避免地造成醫(yī)患矛盾、