免疫檢測技術(shù)基本原理

1、第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試技術(shù)結(jié)合超微量的檢測1Pg/g1門g/g1Rg/g1mg/gIIII1Pg/g1門g/g1Rg/g1mg/gIIIII放射免疫測定法/酶免疫測定法色質(zhì)聯(lián)用分析I放射受體分析氣相色譜(ECD/NPD)氣相色i普(FID)高諷浪fimf(FLD/UVD)極譜法熒尤分光光度法|微生物測定法襟夕卜/叮見分光拓忒圖1各種測定方法的靈敏范圍免疫學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)高度的靈敏性高度的特異性免疫分析技術(shù)的應(yīng)用常用的診斷技術(shù)血凝試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)z體金免疫技術(shù)放射免疫分析技術(shù)凝集試驗(yàn)71

2、A概念：顆粒性抗原（細(xì)菌.紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合,在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物,稱為凝集反應(yīng)。直接凝集反應(yīng)A抗原與抗體直接混合作用,出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。玻片直接凝集法：定性試驗(yàn)A試管直接凝集法:半走量試驗(yàn)玻片直接凝集試驗(yàn)廿+試管法半定量試驗(yàn)ZIS二9SZ二8Z17I寸9二ZE二91二Q二寸二Z二eeeee2間接凝集法先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上（如RBC,乳膠顆粒）f再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)f出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。臨床常用的有間接血凝試驗(yàn)乳膠凝集試驗(yàn)等。間接凝集抑制試驗(yàn)先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng),再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。凝集反應(yīng)）CO1+丄Y人卜可涯性

3、抗應(yīng)咬顧杜抗徉航廉問妊紋*23示ACHB丫（百+）+一A抗體可徐性抗原玫*ta瀕攥抑制顱JMt*卯個九豪*反成示J-5c&goOcex】5加酶標(biāo)抗體6洗滌清稀釋度62248137加底物顯色&觀察結(jié)果Iz0O-OJ641282565121024陽性對照陰性對網(wǎng)包被固相載體：用已知抗原包被固相載體加底物顯色未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加待檢標(biāo)本：使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體：與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定AddAg-Ab)toantigen-coatedwellAddesizyme-cofijugatedsecoriilaT

4、yAddsubstraterrooalor（三）競爭法CompetitiveELISAIncubateantibodywishahliffefiantibody此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體O用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合加底物顯色分別洗滌除去未結(jié)合的成分V丿分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比,計(jì)算標(biāo)本中待測抗原含量對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深;測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多

5、，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用彎飼料中鹽酸克倫特羅的測定矚飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素,簡曲霉毒素）礒飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測躡甲胺磷殘留分析螺甲基對硫磷殘留分析翅咲喃丹殘留分析農(nóng)藥的檢測:主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。植物毒素如罌粟殮.嗎啡、藻類毒素食源性病原菌檢測試劑盒大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡

6、萄球菌食品其他檢測:轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白i轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質(zhì).II1肉制品的摻假檢測：:以辣根過氧化物酶標(biāo)記不同動物肌肉和血清球蛋Ai抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在:摻假率為1%時即可檢出熒光抗體技術(shù)的原理與方法用熒光素標(biāo)記抗原或抗體,再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng),然后在熒光顯微鏡下觀察,形成的IC可散發(fā)出熒光,對標(biāo)本中的抗原或抗體逬行測定和定位。常用的熒光素A異硫鼠酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。常用的方法直接熒光法間接熒光法熒光標(biāo)記抗體熒光標(biāo)記抗體直接法k間接法抗體洗補(bǔ)體法

7、抗體人滌滌補(bǔ)體X熒光標(biāo)記.抗C3抗體；g滌免疫熒光技術(shù)一直接法免疫熒光技術(shù)一直接法熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片免疫熒光技術(shù)間接法免疫熒光技術(shù)間接法熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片免疫熒光技術(shù)卄伴*抗體旅體Xs?AA詵1%詵.4吳尢標(biāo)昶員免皮球姜休o如補(bǔ)體nn詵雄如吳北標(biāo)訖扶XJ3妊休7丄，zCjz玉5冼亍九浚奐尢執(zhí)豐12fThisstate-of-the-artmicroscopecontainifiaccessoriesforQIC,flooredcnce,polarizedlight,phasecontrast,andphotomicrographyusingseveralfilmformat

8、sanddigitalimagecaptureTheOlympusProvisAX-70(circa1998)熒光顯微鏡使用原理A4FWXX、sxx、激發(fā)濾片(BG)標(biāo)本吸收濾片(OG)FITC吸收光峰值：490-495nmFITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650免疫金標(biāo)記技術(shù)免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性,在金標(biāo)蛋白結(jié)合處,在顯微鏡下可見黑褐色顆粒,當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時,肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn),因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這_反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積

9、被放大,稱之為免疫金銀染色(immunogoldsilverstaining,IGSS)。膠體金(colloidalgold)的制備一般采用還原法,常用的還原劑有檸檬酸鈉、蹂酸、抗壞血酸白磷.硼氫化鈉等。向一走濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子,形成金顆粒懸液,也稱金溶膠(goldsolution)。耐金的制備及肆膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性(nm)(ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535決還原100ml0.01%HAuCI4所需量膠體金(CoJZdnJSuJsJ)優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)Fig

10、ureI-GoodqualitygoldparticlesFigure2-Poorqualitygpldparticles瞬錨會物（豆）Adsorptionofproteinstogoldcolloid免疫滲濾測是(IFA)斑點(diǎn)滲漏法其原理與層析法相類同，中心圓點(diǎn)為一株單抗，邊上小點(diǎn)為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點(diǎn)，洗去未結(jié)合抗僚，冠滴加金棕身一株童抗，若宥抗原則形成金-Ab-Ag薄膜的紅色斑點(diǎn)，而邊上是金-Ab-Ab2薄膜的質(zhì)控點(diǎn)，是為金標(biāo)二步法。IFA-一雙BB夾心遽測牖Awpositivetest-ilfa結(jié)弟判斷陽性陰性測定無效二免疫層析測定（ICACros

11、ssectionnegativetest30r層析法將金標(biāo)的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標(biāo)單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應(yīng)抗原，既形成Ag-Ab金復(fù)合物，當(dāng)上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來，顯示陽性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標(biāo)單擾上行此處即被固定下來，作為金標(biāo)單抗質(zhì)控的提示。d匕種方法彳爾金*示一步法。兔抗鼠IgG斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（一）=手持端鼠抗HCG單抗金標(biāo)鼠抗HCG單抗=尿液浸濕標(biāo)志線斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）質(zhì)控線測試線尿樣ICA雙抗體夾心法測晰ICA-競爭法測抗原C3-T免疫層析試驗(yàn)競爭法測小分子抗原原理圖ICA寛爭

12、法結(jié)果灘陰性陽性無效ICA間接法測抗體ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效IFA與ICA的妣IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存48工6個月室溫一年操作步驟351觀察時間3min320min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA穿流(FLOWTHROUGHICA橫流(LATERALFLOW)001、羅立新，繆瓏，潘力，等快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究J中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006,16(2):154-156.2、賴衛(wèi)華，熊勇華，陳高明，等.應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究J食品科學(xué),2005,26(5):204-207.3、i甚志強(qiáng)，段惠莉，王新為，等.

13、大腸埃希菌0157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測J中國公共衛(wèi)生，2005,21(4):705-706.4、謝昭聰，宋志強(qiáng)，呂敬章,等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究J中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2005,28(3):163-165.5、王中民，李君文/王新為/等.免疫金滲濾試驗(yàn)檢測食品中沙門氏菌的研究J.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2001,29(4):45-47.6、劉永德，汪毅，陳禹雷，免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究J上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2005,23(3):321-324.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)AoBo加尿樣除去濾器加膠體金標(biāo)記抗體加洗滌液950684512KD1204124KD

14、950684512KD1204124KD免疫印跡法圖解SDS裂解0病毒聚丙酰胺凝膠電泳第四節(jié)放射性核素標(biāo)記技術(shù)、常用標(biāo)記方法八標(biāo)記免疫物的分離與純化eR:放射性核素示蹤咼靈敏-不直接探測待測物，而探測待測物上的標(biāo)記信號（標(biāo)記物的放大效應(yīng)）L免疫學(xué)反應(yīng)高特異=廢除以往沿用的無機(jī)或有機(jī)試劑，代之以抗體為結(jié)合劑常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、1251的標(biāo)記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）直接法（氯胺T法）-NHCHONH-bH氯胺TNa125I4。C-NHCHONH-CH2bHOH間接法（連接法）OHIVNSHPP+Na125Ich2OIIH-C-C-O-N-C-CH.IIII-HOO=C-

15、C-CH0氯胺TICH?O|-IIH-C-C-O-N-C-CHIIIIHOO=CCCHOHX/i25iVIch2IIIIHOO=C-C-CH2間接法（連接法）+NH?-蛋白質(zhì)OIIH-C-C-O-N-C-CH.OHOH人腫1CH.I-h-c-c-n-蛋白質(zhì)IIIIHOH標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離放射性核素方法：柱層析2、鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）AA+earOOOO結(jié)合相游離相O夕O&O含放射免疫分析法的原理與方法B液閃儀Y計(jì)數(shù)器化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫技術(shù)直接化學(xué)發(fā)光酶促化學(xué)發(fā)光特點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光特點(diǎn)標(biāo)記免疫分析三方式與四環(huán)節(jié)三個方式A、直接法B、間接法C、夾心法四環(huán)節(jié)為:1抗體生產(chǎn)2、標(biāo)記試劑制備3、分