醫(yī)學(xué)專題鹽析沉淀蛋白質(zhì)時

1、第三章 蛋白質(zhì)的通性、純化與表征1、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：酸堿性質(zhì)、膠體性質(zhì)與沉淀、變性、顏色反應(yīng)2、分離純化的方法：鹽析、電泳、等電聚焦、層析等3、表征：活力、比活力2021/7/20 星期二1蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳1、酸堿性質(zhì)2021/7/20 星期二2PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO-NH2陽離子PHPI兼性離子PH=PI

2、H+OH-H+OH-可解離基團有末端和側(cè)鏈故pI與酸性、堿性氨基酸的數(shù)目有關(guān)如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等電點偏酸性有些球蛋白的可解離基團只有變性后才能完全滴定沒有鹽類干擾時的等電點叫等離子點2021/7/20 星期二3蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達1-100nm，處于膠體顆粒的范圍。因此，蛋白質(zhì)具有親水溶膠的性質(zhì)。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。2、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：2021/7/20 星期二4蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）； 2）帶相同電荷。3)大小為1-1

3、00nm的膠體顆粒+2021/7/20 星期二5蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)的沉淀作用2021/7/20 星期二6加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。 分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2. 加有機溶劑加重金屬鹽加生物堿試劑 單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。2021/7/20 星期二7在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷

4、狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和條件有機溶劑沉淀法等?？赡娉恋?021/7/20 星期二8在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、常溫有機溶劑、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀2021/7/20 星期二9一、蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用

5、下，其空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而改變其理化性質(zhì)，并失去其生物活性，稱為蛋白質(zhì)的變性。二、變性的實質(zhì)是破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，并不引起一級結(jié)構(gòu)的改變。 蛋白質(zhì)的變性三、蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都變性后的蛋白質(zhì)。四、加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為凝固。因此，凡凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。 2021/7/20 星期二10反應(yīng)名稱試 劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking

6、-Cole反應(yīng))乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色Trp坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng))-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反應(yīng))堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍色自由氨基及羧基-氨基酸4、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)：鑒定蛋白質(zhì)的量OHN2021/7/20 星期二11大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定。初步定量，若精細定量用考馬斯亮藍染色5、蛋白質(zhì)的紫外吸收2021/7/20 星期二1

7、2分離純化之前保證蛋白質(zhì)一定的純度依據(jù)：大小、形狀、溶解度、酸堿性、吸附性及對配體的親和性若要研究蛋白質(zhì)的功能則要求高級結(jié)構(gòu)完整難度大，迄今幾百個蛋白質(zhì)的單晶（單晶的天然結(jié)構(gòu)都沒有發(fā)生變化）蛋白質(zhì)的分離與純化方法2021/7/20 星期二13（一）鹽析與有機溶劑沉淀： 鹽溶鹽析： 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。2021/7/20 星期二14常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。 鹽析時，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點處效果最好。 鹽析沉淀蛋白質(zhì)時，通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。2021/7/20 星期二15分段鹽析： 半飽和硫酸銨溶液可沉

8、淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白。 2021/7/20 星期二162. 有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)： 凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀原理是： 脫水作用； 使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。2021/7/20 星期二17（二）電泳：帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)蛋白質(zhì)分子在溶液中可帶凈的負電荷或帶凈的正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同的蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。 2021/7/20 星期二18電泳蛋白質(zhì)在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象

9、。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進行分離純化。2021/7/20 星期二19自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。（3）雙向電泳2021/7/20 星期二204）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。+ 5）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。-+兩種凝膠電泳2021/7/20 星期二21等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。分離同工酶+5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定

10、pH梯度通電+2021/7/20 星期二22SDSPAGE中SDS的作用：陰離子去污劑，變性，蛋白質(zhì)伸展態(tài)屏蔽蛋白質(zhì)的電荷，都帶負電荷使得蛋白質(zhì)的形狀趨于一致所以在這種特殊的電泳中，遷移率與蛋白質(zhì)電荷無關(guān)，與蛋白質(zhì)的形狀無關(guān)，處決于蛋白質(zhì)的大?。ǚ肿恿浚?021/7/20 星期二23（三）層析：層析（chromatography)是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離分析的技術(shù)方法。主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析、HPLC等。 2021/7/20 星期二24凝膠過濾分離蛋白質(zhì)2021/7/20 星期二25（

11、四）超速離心：利用物質(zhì)密度的不同，經(jīng)超速離心后，分布于不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比。 2021/7/20 星期二26蛋白質(zhì)相對分子量在10 000-1 000 000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在25-50*104 g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。 s = v2x v =沉降速度（dx/dt）=離心機轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s） x =蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心的距離（

12、cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=110-13（s）2021/7/20 星期二27蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系M = RTsD（1V）R氣體常數(shù)（8.314107ergsmol -1 度-1）T絕對溫度D擴散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計）V蛋白質(zhì)的微分比容（m3g-1）溶劑密度（20，gml-1） s沉降系數(shù)2021/7/20 星期二28酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。酶促反應(yīng)速率酶（活力）單位：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。（U/g，U/ml）在最適的反應(yīng)條件（25）下，每分鐘內(nèi)催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定為一個酶活力單位，即 1IU=1mol/min在