從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶

1、從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶10級七年二班第五組1材料的選擇因動物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗材料。2材料的預(yù)處理細(xì)胞破碎 機(jī)械破碎法：可選用搗碎法或勻漿法。 使用勻漿法時應(yīng)先將大塊的組織或者細(xì)胞團(tuán)用組織搗碎機(jī)或研磨器械搗碎分散。 研磨法常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎故本實驗不采用。 物理破碎法：凍融法、滲透壓法和超聲波破碎法均可。 使用凍融法應(yīng)注意不能在過高的溫度下操作，以免引起酶的變性失活。 使用超聲波破碎法應(yīng)注意操作需在冷庫中進(jìn)行，或?qū)悠分糜诒≈?，并采用問歇操作，如破?060 s，間歇1 min，如此反復(fù)進(jìn)行。 化學(xué)破

2、碎法：常用的化學(xué)試劑有： 有機(jī)試劑（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； 表面活性劑（Tween、特里頓（Triton）等）； 螯合劑（EDTA：乙二胺四乙酸）等。他們都可以增加細(xì)胞膜的通透性，是酶容易釋放。 酶溶法：因?qū)Υ烁蚊覆涣私夤什徊捎么朔椒ā?32.防止蛋白酶的水解作用：預(yù)防的措施是加入蛋白酶抑制劑。常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）3.除核酸：一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需要大量的試驗來選定，已知的有1%2%的鏈霉素硫酸鹽、PEG、溶菌酶等。4酶的提取1

3、.常用方法：鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取。 本實驗中因缺乏酶的更多信息，故采用鹽溶液提取法。 鹽溶液提取：適用于大多數(shù)酶。鹽溶現(xiàn)象：大多數(shù)P酶在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加。鹽析現(xiàn)象：在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低。 影響酶提取的主要因素： 酶在所使用溶劑中的溶解度； 酶向溶劑擴(kuò)散的速度：酶向溶劑擴(kuò)散的速度與溫度（）、黏度（）、擴(kuò)散面積（）、擴(kuò)散距離（）及兩相間的濃度差（）有密切關(guān)系； 溫度：在不影響酶活性的條件下，適當(dāng)提高溫度，有利于酶的提取。適當(dāng)提高溫度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的擴(kuò)散速度，但是溫度過高，易引起

4、酶的變性失活，所以提取時溫度不宜過高。5 pH值：提取時，溶液的pH值不宜過高或過低，以免引起酶的變性失活，并避開酶的等電點。當(dāng)pH值等于某酶的等電點時，酶分子的溶解度最小。 提取液的體積：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度降低，對進(jìn)一步的分離純化不利。因此，控制提取液的總量一般為原料體積的35倍。6酶的分離常用的酶分離方法有沉淀法、層析法、電泳法、離心法、過濾和膜分離法、萃取法等。 因本實驗中對此種酶的了解有限，故應(yīng)采用等電點沉淀法。已知所需酶的pI=6.2，故適宜采用此種方法進(jìn)行分離。 等電點沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，及不同兩性電解質(zhì)的等

5、電點不同這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。在溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點時，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來。因此可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH，把目的酶和雜蛋白分開。但由于蛋白質(zhì)在pI點附件一定范圍的pH內(nèi)都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當(dāng)多的蛋白質(zhì)的pI點很靠近，所以該法的回收率和純化倍數(shù)都不理想，一般只用于酶的粗分離階段。7 其他沉淀法：鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法需根據(jù)酶的種類配置合適濃度的溶液，故無法采用。熱處理沉淀法同樣不宜。 電泳法：對該酶的帶電量不了解。（等點凝膠

6、電泳：會使該酶的亞基分開而不能采用）。 層析法：對酶和層析柱的吸附效果不了解，無法進(jìn)行分離。 離心法：對酶的大小密度不了解，無法知道所需酶的位置。 過濾法、膜分離法：對酶的大小不了解。 萃取分離法：對酶的溶解度不了解。8酶的純化、精制1.結(jié)晶：結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程，不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50%以上，方能進(jìn)行結(jié)晶。常用方法有鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點結(jié)晶法由于本實驗?zāi)康漠a(chǎn)物為酶，故采用鹽析結(jié)晶法。原因：主要用于大分子如蛋白質(zhì)、酶、多肽等的結(jié)晶。特點：不耐熱，對pH變化及有

7、機(jī)溶劑十分敏感。用中性鹽作為沉淀劑，安全、操作簡單。鹽析結(jié)晶法操作包括：加固體鹽法；飽和鹽溶液；透析擴(kuò)散法。 有機(jī)溶劑結(jié)晶法：針對小分子物質(zhì)的結(jié)晶。等電點結(jié)晶法：多用于一些兩性物質(zhì)。92.濃縮：從低濃度酶液中除去部分水或其他溶劑而成為高濃度酶液的過程。濃縮的方法很多，離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達(dá)到濃縮效果。本實驗采用真空蒸發(fā)濃縮法。真空蒸發(fā)濃縮：在一定的真空條件下，使酶液在60以下汽化蒸發(fā)，進(jìn)行濃縮的過程。 一般說來，在不影響酶活力的前提下，適當(dāng)提高溫度、降低壓力、增大蒸發(fā)面積都可以使蒸發(fā)速度提高。3

8、.干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分，以獲得含水分較少的固體物質(zhì)的過程。常用方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸附干燥等。本實驗采取任何一種均可。 10 真空干燥：真空干燥是在與真空系統(tǒng)相連接的密閉干燥器中，一邊抽真空一邊加熱，使酶液在較低的溫度條件下蒸發(fā)干燥的過程。在真空泵之前需要設(shè)置水蒸氣凝結(jié)收集器，以免汽化產(chǎn)生的水蒸氣進(jìn)入真空泵。酶液真空干燥的溫度一般控制在60以下。 冷凍干燥：冷凍干燥是先將酶液降溫到冰點以下，使之凍結(jié)成固態(tài)，然后在低溫下抽真空，使冰直接升華為氣體，而得到干燥的酶制劑。冷凍干燥得到的酶質(zhì)量較高，結(jié)構(gòu)保持完整，活力損失少，但是成本較高。特

9、別適用于對熱非常敏感而價值較高的酶類的干燥。 11噴霧干燥：噴霧干燥是通過噴霧裝置將酶液噴成直徑僅為幾十微米的霧滴，分散于熱氣流中，水分迅速蒸發(fā)而得到粉末狀的干燥酶制劑。噴霧干燥由于酶液分散成為霧滴，直徑小，表面積大，水分迅速蒸發(fā)，只需幾秒鐘就可以達(dá)到干燥。在于燥過程中，由于水分迅速蒸發(fā)，吸收大量熱量，使霧滴及其周圍的空氣溫度比氣流進(jìn)口處的溫度低，只要控制好氣流進(jìn)口溫度，就可以減少酶在干燥過程中的變性失活。12 氣流干燥：氣流干燥是在常壓條件下，利用熱氣流直接與固體或半固體的物料接觸，使物料的水分蒸發(fā)而得到干燥制品的過程。氣流干燥設(shè)備簡單，操作方便，但是干燥時間較長，酶活力損失較大。需要控制好氣流溫度、氣流速度和氣流流向，同時要經(jīng)常翻動物料，使之干燥均勻。 吸附干燥：吸附干燥是在密閉的容器中用各種干燥劑吸收物料中的水